食品科学技术学报201505 - page 29

长和真菌毒力因子产生等不同的生理阶段[10] 的影
响方面,但有关壳寡糖对真菌生长及毒素分泌之间
相关性方面的研究却鲜有报道。
本研究拟运用液体培养的方式, 通过静止培养
和摇床培养实验, 揭示壳寡糖在不同温度培养条件
下对扩展青霉菌体生长和展青霉素分泌的影响, 以
期为壳寡糖在果蔬采后病害控制中的应用提供
参考。
1摇 材料与方法
1郾 1摇 菌种、材料与试剂
扩展青霉由实验室从感染青霉病的发病苹果果
实中分离纯化,回接验证所得( 经鉴定编号为 M1),
于 4 益 PDA 斜面培养基中保存; 壳寡糖乙酰化度
2% ~ 10% ,分子质量小于2 000 u, 大连中科格莱克
生物技术有限公司;乙腈 (Merck,德国) 和冰乙酸为
色谱纯,其他试剂均为分析纯 ( 上海国药集团化学
试剂有限公司); 展青霉素标准品 ( Sigma, 美国 , 纯
度逸98% );超纯水(Millipore, 美国)。
1郾 2摇 主要仪器设备
BMJ -250C 型霉菌培养箱, 上海博讯实业有限
公司医疗设备厂;BK5000- LEDR 型光学显微镜, 重
庆奥特光学仪器有限责任公司;Agilent -1260 型高
效液相色谱仪, 美国安捷伦科技有限公司;IS -RDS3
型恒温振荡器,美国精骐有限公司;RE-52A 型旋转
蒸发仪,上海荣生化学仪器厂; YGC -12 型氮吹仪,
郑州宝晶电子科技有限公司; 酸度计, 灭菌锅, 无菌
操作台。
1郾 3摇 实验方法
1郾 3郾 1摇 扩展青霉孢子悬浮液及壳寡糖母液的制备
将扩展青霉接种到新鲜 PDA 斜面上,25 益 下培
养 7 d 后,加入无菌生理盐水, 将菌落表面的孢子刮
下,用灭菌的 4 层纱布过滤除去菌丝等杂质, 用血球
计数板计数,将孢子浓度调整至 10 6 CFU / mL。
准确称量 2郾 5 g 壳寡糖粉末,经紫外杀菌后, 在
无菌操作台中加入无菌水中, 待壳寡糖在水中完全
溶解后,定容到 100 mL,制备成质量浓度为 25 g / L 的
壳寡糖溶液。
1郾 3郾 2摇 扩展青霉菌体生长和产毒实验
取不同体积的壳寡糖母液按照比例加入到灭菌
的 PDB 母液中 , 制备成壳寡糖质量浓度为 0,1郾 0,
5郾 0,10郾 0 g / L 的 PDB 培养基, 调节 pH 值为自然状
态 。 混匀后以每瓶 40 mL 添加量置于 250 mL 无菌
锥形瓶中,接入 0郾 4 mL 浓度为 1 伊 10 6 CFU / mL 的
扩展青霉孢子悬浮液 [11] 。 将锥形瓶置于 25 益,相
对湿度 90% 的霉菌培养箱中静置培养 ,分别在培养
第 2,4、6,8,10 d 取样,抽滤收集菌体 ,于 60 益 下烘
干至恒重,称重。 量取 10 mL 抽滤所得滤液,用于提
取测量展青霉素含量 , 每组实验设 3 个平行, 重复
3 次。
将壳寡糖质量浓度为 0,5 g / L 的处理组分别置
于 25,16,4 益,湿度为 90% 的霉菌培养箱中静置培
养 ,分别于 2,3,20 d 后开始取样,以后分别隔 2,3,5
d 取样,用来测定不同温度培养条件下扩展青霉菌
体重量和展青霉素含量变化,每组实验设 3 个平行 ,
实验重复 3 次。
另将壳寡糖质量浓度为 0,5 g / L 的处理组分别
置于 25,4 益 的摇床 (200 r / min) 中进行培养, 分别
于 2,15 d 后开始取样,以后分别隔 2,3 d 取样, 用来
测定摇床培养条件下扩展青霉菌体重量和展青霉素
含量变化,每组实验设 3 个平行 ,实验重复 3 次 。
1郾 3郾 3摇 展青霉素的测定
展青霉素测定采用高效液相色谱法。 展青霉素
的提取与测定参照测定方法[12] , 并稍做修改。 向待
测样品中加入 15 mL 乙酸乙酯震荡提取 1 h,静置分
层后,收集上层的乙酸乙酯相。 重复 2 次, 合并有机
相 ,加入 10 mL Na2 CO3 溶液 15 g / L,震荡 1 min,静置
分层后 ,再用 10 mL 的乙酸乙酯对 Na 2 CO3 层提取 1
次 ,合并乙酸乙酯提取液, 于 40 益 水浴上旋转蒸发
至液体剩余 1 ~ 2 mL,将浓缩液转移至 5 mL 离心管
中 ,于 40 益 下氮气吹干, 用 1郾 0 mL pH 值为 4郾 0 的
乙酸水溶液溶解残留物,经 0郾 45 滋m 滤膜过滤后,用
HPLC 进行测定 。 测定条件: 色谱柱 摇 Agilent SB -
C18 柱,250 mm 伊 4郾 6 mm,粒径 5 滋m;流动相,乙腈-
水 ( 体积比 10 颐 90); 流速 摇 1郾 0 mL / min;柱温 摇 30
益;检测波长摇 276 nm;进样量 摇 20 滋L。
1郾 4摇 数据处理与分析
实验所有处理均重复 3 次, 实验结果表示为平
均值 依 标准差的形式 。 数据统计分析采用 SPSS
(Version 20郾 0) 软件进行。 比较两个以上数据时,采
用单因素方差分析,且先对平均数进行 Levene爷 s 等
方差性分析 。 若方差齐性,则用 Ducan爷 s 检验进行
多重比较;若不满足方差齐性,则用 Dunnett爷s T3 检
验进行多重比较 。 比较两个平均数时, 采用双独立
样本 T 检验。 p < 0郾 05 时为差异显著。
42 食品科学技术学报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 2015 年 9 月