47 - 食品科学技术页

筛选培养基: CMC 10 g / L, 酵母粉 5 g / L,
Na2 CO3 3 g / L,MgSO4·7H2 O 0郾 1 g / L,FeSO4·7H2 O
5 mg / L,MnSO 4 5 mg / L,琼脂 20 g / L,pH 9郾 0. 121 益
下灭菌 15 min.
活化培养基: 酵母粉 5 g / L,蛋白胨 10 g / L,NaCl
10 g / L,pH 7郾 0. 121 益 下灭菌 15 min.
发酵培养基: 葡萄糖 40 g / L,大豆蛋白胨 8 g / L,
酵母粉 6 g / L, MgSO 4·7H2 O 4 g / L, MnSO4 4 g / L,
KH2 PO 4 10 g / L, NaH2 PO4 8 g / L,pH 6郾 0. 115 益 下
灭菌 20 min.
1郾 3摇 实验方法
1郾 3郾 1摇 目标菌株获得
收集山东烟台第一海水浴场附近的丰富有机质
土壤,梯度稀释后涂布至筛选培养基,30 益 培养至
长出单菌落. 刚果红染色并 NaCl 洗涤后观察,挑取
透明圈与菌落直径比大的菌落接种至添加 20 g / L
葡萄糖的无琼脂筛选培养基中 , 培养 24 h 后测酶
活, 选取酶活较高菌株 B16.
1郾 3郾 2摇 培养条件
将种子培养液按体积分数为 2% 的比例接种于
发酵培养基中, 于 28 益、220 r / min 摇瓶培养 24 h.
发酵液经 8 000 r / min 离心 5 min 后 , 取上清用于酶
活测定, 测定均重复 3 次并取平均值.
1郾 3郾 3摇 菌属鉴定
单菌落形态观察, 经染色 ( 简单、 革兰氏和芽
孢) 后镜检. 生化鉴定参照文献 [13] 中的描述方
法. 抽提菌株基因组 DNA 进行电泳分析,以 PCR 通
用引物进行扩增, 电泳检测并切胶测序. 通过
BLAST 法将序列与 NCBI 数据库序列进行同源比
较, 建立系统发育树.
1郾 3郾 4摇 纤维素酶活性测定
羧甲基纤维素酶 ( CMCase) [14] : 适当稀释的酶
液 1 mL 加 1% CMC 液 (pH 8郾 0)1 mL,50 益 反应 15
min,加 3 mL DNS 试剂, 煮沸显色 5 min. 加水定容
至 25 mL,在 540 nm 测吸光值. 空白处理:等量酶液
煮沸 10 min 灭活,后续过程同样品测定. 根据标准
曲线计算酶活,以 1 mL 酶液 1 min 水解纤维素生成
1 滋g 葡萄糖的量为 1 个活力单位 (U) .
滤纸酶(FPase) [15] :50 mg 滤纸浸入 1 mL 缓冲
液(pH 8郾 0), 加 1 mL 稀释的酶液,50 益 反应 60
min,离心去不溶物,其余同 CMCase 测定.
茁鄄 葡萄糖苷酶( 茁 鄄Gase) 活力[16] : 以 1 mL 0郾 5%
水杨素为底物,其余同 CMCase 测定.
微晶纤维素酶 (C1 ) 活力[17] :1 mL 微晶纤维素
溶液(1% ) 加 1 mL 稀释酶液 , 50 益 下反应 120 min
后 ,离心去不溶物,其余同 CMCase 测定.
1郾 3郾 5摇 酶学性质初步研究
测定 CMCase 活力作酶学性质的研究指标.
1郾 3郾 5郾 1摇 最适温度及热稳定性
不同温度下反应 15 min 后测定 CMCase 酶活
性 , 确定最适反应温度. 酶液在不同温度条件下
(pH 8郾 0 的缓冲液) 保存 60 min 后, 测定 CMCase 酶
活性, 分析温度稳定性.
1郾 3郾 5郾 2摇 最适 pH 值及酸碱稳定性
不同 pH 值下反应 15 min 后测定 CMCase 酶活
性 ,确定最适反应 pH 值 . 酶液在不同 pH 值条件下
(40 益) 保存 60 min 后, 测定 CMCase 酶活性 , 确定
酸碱稳定性 .
1郾 3郾 5郾 3摇 金属离子对酶活性的影响
在酶活测定体系中分别添加 0郾 000 1 mol / L 和
0郾 01 mol / L 两个浓度梯度的金属盐 , 考察金属离子
对酶活性的影响 .
2摇 结果与分析
2郾 1摇 菌株的分离鉴定
刚果红染色法筛选的纤维素酶高活力菌株 B16
在 LB 培养基平板上呈乳白色, 中央凸起, 圆形 , 表
面湿润 , 周围光滑, 不透明无光泽. 生理生化结果
( 见表 1) 与文献[18] 中描述特征比对,初步判定为
芽孢杆菌属 . 革兰氏染色呈阳性, 杆状不成链且产
芽孢( 约中央位置)( 见图 1) .
表 1摇 菌株 B16 的生理生化指标
Tab. 1摇 Physiological and biochemical characteristics
of strain B16
指标 结果 指标 结果
淀粉水解 + 三糖铁 -
糖酵解 - 麦芽糖 +
VP 测定 + 木糖 +
9% NaCl + 糊精 +
13% NaCl + 硫化氢酶 -
15% NaCl + 苯丙氨酸脱氨酶 -
甲基红试验 + 20 益 +
明胶液化 + 30 益 +
过氧化氢酶 + 40 益 +
尿素酶 - 50 益 -
摇 摇 以总 DNA 为模板, 采用 16S rDNA 的通用引物
进行 PCR 扩增,胶回收纯化后测序,得到一条 1 389 bp
44 食品科学技术学报 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 2014 年 5 月