42 - 食品科学技术页
基本HTML版本
塞米松
、
胰岛素
、IBMX、
油红
O、
多聚甲醛
,
美国
Sig鄄
ma
公司
;
高糖培养基
(DMEM)、
新生小牛血清
、
胰蛋
白酶
,
美国
Gibco
公司
;
异丙醇
、
无水乙醇等其他试
剂均为分析纯
.
1郾 2摇
仪器设备
Axiovert 200
型倒置显微镜
,
德国
Zeiss
仪器有
限公司
;Galaxy S
型
CO
2
培养箱
,
英国
RS Biotech
公
司
;SPECTRA MAX 190
型连续波长酶标仪
,
美国
Molecular Devices
公司
.
1郾 3摇
实验方法
1郾 3郾 1摇
3T3-L1
前体脂肪细胞的培养
将
3T3-L1
前体脂肪细胞置于体积分数为
10%
胎牛血清的
DMEM
中
,
在
37 益,5 % CO
2
,95%
湿度
条件下培养
. 2 ~ 3 d
换液
1
次
,
细胞汇合达
80%
左右
时
,
用质量分数为
0郾 25%
胰蛋白酶消化
,
传代培养
.
1郾 3郾 2摇
3T3-L1
前体脂肪细胞诱导分化条件的优化
3T3-L1
前体脂肪细胞按
1 伊 10
4
个
/
孔接种于
96
孔板
,
待细胞汇合后
,
接触抑制
2 ~ 3 d,
参考
Student
等
[8]
分化前体脂肪细胞的方法
,
设计正交试
验
,
优化
3T3-L1
细胞的诱导分化条件
.
选取
IBMX、
地
塞米松
、
联合诱导时胰岛素作用量
、
联合诱导时间
、
胰
岛素单独诱导时间以及胰岛素单独作用量
6
个影响因
素为自变量
,
每个自变量设计
3
个水平
,
做出
3
水平
7
因素的正交试验设计
,
实验因素和水平如表
1.
表
1摇 3T3-L1
前体细胞诱导分化条件因素水平表
L
18
(3
7
)
Tab. 1摇 Levels and factors of induction and differentiation of 3T3-L1 preadipocytes L
18
(3
7
)
因素
/
水平
c
(IBMX) /
(滋mol·L
-1
)
c
(
地塞米松
) /
(滋mol·L
-1
)
籽
(
胰岛素
) /
(滋g·mL
-1
)
联合诱导
时间
/ h
籽
(
胰岛素单独使用
) /
(滋g·mL
-1
)
分化时间
/
h
1
0
0郾 25
1
48
10
48
2
500
0郾 5
5
60
5
60
3
750
1
10
72
1
72
1郾 3郾 3摇
油红
O
染色
待
90%
左右的
3T3-L1
前体脂肪细胞分化成为
成熟的脂肪细胞时
,
参照
Ramirez鄄Zacarias
等
[9]
的方
法进行油红
O
染色
.
细胞诱导分化结束后去除培养
基
,
用质量分数为
4%
的多聚甲醛固定
1 h,
加入油
红
O
溶液染色
2 h,
无菌水清洗后
,
倒置显微镜下观
察
.
此后
,
加入异丙醇洗脱
,
在
520 nm
波长检测
.
1郾 3郾 4摇
数据处理
采用正交试验设计助手
域( v3郾 1)
软件进行方
差分析
.
2摇
结果与分析
2郾 1摇 3T3-L1
前体脂肪细胞诱导分化条件正交试
验结果
3T3-L1
前体肪细胞诱导分化条件正交试验结
果如表
2,
极值分析的结果表明
,
各因素对诱导分化
结果影响的主次顺序为
:IBMX (A)、
联合诱导时间
(D)、
胰岛素单独作用量
(E)、
联合诱导时胰岛素作
用量
(C)、
地塞米松
(B)、
胰岛素单独作用时间
(F),
即
IBMX
用量对
3T3-L1
前体脂肪细胞诱导分化为
成熟脂肪细胞影响最大
,
而胰岛素单独作用时间的
影响最弱
.
同时
,
比较均值可初步确定各因素的最
优水平为
A
2
B
3
C
1
D
3
E
1
,
即
IBMX 500 滋mol / L,
地塞米
松
1 滋mol / L,
联合诱导中胰岛素用量为
1 滋g / mL,
诱
导时间为
72 h,
胰岛素单独用量为
10 滋g / mL,
由于
胰岛素单独作用时间各水平之间没有显著差异
,
因
此选择诱导
48 h
为宜
.
3T3-L1
前体脂肪细胞诱导分化条件正交试验
的方差分析如表
3.
可以看出
,IBMX
用量对诱导分
化的影响达极显著水平
,
联合诱导时间和胰岛素单
独作用量的影响达到显著水平
,
而地塞米松
、
联合诱
导中胰岛素作用量及单独作用时间的影响并不显
著
.
表明
IBMX
为影响诱导分化的最关键因素
,
联
合诱导时间和胰岛素单独作用量为主要影响因素
.
2郾 2摇
油红
O
染色的显微镜观测结果
不同诱导条件下成熟脂肪细胞的油红
O
染色
结果如图
1.
未经诱导分化的
3T3- L1
前体脂肪细
胞呈梭形或不规则三角形
,
胞内无脂滴
(
图
1A) .
当
细胞汇合后进入接触抑制期
,
细胞处于生长停滞状
态
,
经
IBMX、
地塞米松和胰岛素联合诱导
、
胰岛素
单独诱导后
,
在视野下可观测到细胞开始生成小的
环状脂滴
. 4 ~ 6 d
后小脂滴汇聚成大脂滴
,
细胞变
得透明
,
具备成熟脂肪细胞的典型形态特征
. 8 ~ 10
d
后
,
部分诱导条件下的前体脂肪细胞分化率可达
90% ~ 95% ,
用油红
O
可将胞内脂肪特异性染成红
色脂滴
(
图
1B
至图
1S) .
而未经
IBMX
诱导的
93
第
32
卷 第
3
期
摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
王友升等
:
前体脂肪细胞
3T3-L1
诱导分化条件的优化
