产胞外多糖的影响
,
并采用响应面分析法对发酵条
件进行优化
,
以期提高此种具有生物活性的胞外多
糖的产量
,
为其在发酵乳制品中的应用奠定基础
。
1摇
材料与方法
1郾 1摇
材料与仪器
植物乳杆菌
YW11 (NCBI
检索号
:KM265361)
分离于西藏灵菇样品
,
本课题组实验室保藏
。
三氯乙酸
( trichloroacetic acid,TCA)、
葡萄糖
、
乳
糖
、
麦芽糖
、
果糖
、
蔗糖
、
半乳糖
、
大豆蛋白胨
、
胰蛋白
胨
、
酪蛋白胨
、
蛋白胨
、
浓硫酸
、
重蒸酚
、
无水乙醇均
为分析纯
,
国药集团化学试剂有限公司
。
CR21G芋
型立式高速冷冻离心机
,
日本
HITA鄄
CHI
公司
;Elx800
型酶标仪
,
美国伯腾仪器有限公
司
;MLS -3750
型高压蒸汽灭菌器
,
日本三洋公司
;
S20
型数显
pH
计
,
上海梅特利
-
托利多公司
;THZ -
D
型恒温培养箱
,
上海一恒仪器科技有限公司
。
1郾 2摇
培养基的配制
半合成培养基
( semi鄄defined medium,SDM)
是
由去离子水
1 000 mL、
胰蛋白胨
10 g、
酵母氮源
6郾 7
g、K
2
HPO
4
2 g、C
6
H
5
Na
3
O
7
·2H
2
O 5 g、CH
3
COONa 5
g、MgSO
4
·7H
2
O 0郾 2 g、MnSO
4
·H
2
O 0郾 05 g、
葡萄糖
20 g、
吐温
80 1 mL,1 mol / L
乙酸溶液调节
pH
值至
6郾 6,121 益
灭菌
15 min
制成
。
1郾 3摇
植物乳杆菌
YW11 EPS
的分离提取
将植物乳杆菌
YW11
连续活化两代后接种至
SDM
培养基中
,37 益
静置培养
16 h,
发酵结束后
,
于
100 益
水浴加热
15 min,
以灭活可能存在的降解多
糖的酶类
。
发酵液中的
EPS
参考
Sahlan
等
[5]
的方
法进行分离提取
。
向植物乳杆菌
YW11
发酵液中加
入质量分数
80%
的
TCA,
调节
TCA
质量分数到
4% ,
于常温下搅拌
2 h
后
,4 益,10 000 r / min,
离心
45 min,
去除发酵液中的细胞和蛋白
。
将上清液转
移出来
,
加入上清液两倍体积的无水乙醇
,4 益
静置
12 h,10 000 r / min,4 益,
离心
30 min。
用蒸馏水溶解
沉淀
,
装入分子截流量为
8 000 ~ 14 000 u
的透析袋
中
,
每
8h
换一次蒸馏水
,
透析
24 h
[6]
。
1郾 4摇 EPS
含量测定
采用苯酚
-
硫酸法测定
EPS
含量
,
以葡萄糖为
标准品
,
测定
490 nm
处的吸光度值
。
本实验测得的
葡萄糖标准曲线回归方程为
:
y
= 0郾 007 5
x
- 0郾 006 3,
R
2
=0郾 999 1。
1郾 5摇
不同因素对植物乳杆菌
YW11
产
EPS
的影响
EPS
的产量不仅取决于产
EPS
微生物自身的
遗传特性
,
也与发酵过程中微生物所处的环境状况
有关
[7]
。
对植物乳杆菌
YW11
发酵条件相关的
8
个
因素
(
包括培养基的碳源及其质量浓度
、
氮源及其
质量浓度
、
接种量
、
发酵温度
、
发酵时间
、
培养基初始
pH
值
)
分别进行研究
。
以
EPS
产量为指标
,
以
SDM
培养基为基础培养
基
,
将
SDM
培养基中的碳源
(
葡萄糖
)
分别以等量
的乳糖
、
半乳糖
、
麦芽糖
、
蔗糖
、
果糖
、
葡萄糖替换
;
选
取乳糖质量浓度分别为
5,10,15,20,25,30 g / L;
将
SDM
培养基中的氮源
(
胰蛋白胨
)
分别以等量的大
豆蛋白胨
,
普通蛋白胨
,
酪蛋白胨
,
胰蛋白胨替换
;
选
取大豆蛋白胨质量浓度分别为
5,10,15,20,25,30
g / L;
选取接种量分别为
1% ,2% ,3% ,4% ,5% ,6%
(
其他发酵条件
:
发酵温度
37 益,
发酵时间
16 h,pH
值
6郾 6);
选取发酵温度分别为
22,27,32,37,42 益
(
其他发酵条件
:
接种量
1% ,
发酵时间
16 h,pH
值
6郾 6);
选取发酵时间分别为
6,12,18,24,30 h(
其他
发酵条件
:
接种量
1% ,
发酵温度
37 益,pH
值
6郾 6);
选取培养基初始
pH
值分别为
4,5,6,7,8,9(
其他发
酵条件
:
接种量
1% ,
发酵温度
37 益,
发酵时间
16 h)。
1郾 6摇
二水平正交试验设计
结合单因素实验
,
针对影响植物乳杆菌
YW11
胞外多糖产量的因素
,
设计
L
8
(2
7
)
正交试验
,
确定
影响因素的主次顺序
。
1郾 7摇
响应面试验设计
根据响应面优化分析原理
( Box - Behnken de鄄
sign,BBD),
通过
Design -Expert 8郾 0郾 5b
软件设计响
应面试验
,
研究植物乳杆菌
YW11
产
EPS
的最佳发
酵条件
。
得到最优条件后
,
通过验证实验
,
验证模型
的有效性
。
2摇
结果与分析
2郾 1摇
不同因素的影响结果
2郾 1郾 1摇
碳源对
EPS
产量的影响
碳源为微生物生长提供最主要碳素和能量
。
由
于不同微生物的酶系存在差异
,
因此微生物对不同
种类碳源的利用程度也存在相应差异
[8]
。
为了筛
选最适碳源
,
分别选用
6
种不同碳源
(
葡萄糖
、
果
糖
、
蔗糖
、
乳糖
、
麦芽糖
、
半乳糖
)
按
20 g / L
的添加量
34
第
34
卷 第
1
期
摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
曹永强等
:
植物乳杆菌
YW11
生产胞外多糖的发酵条件研究
