1摇
材料与方法
1郾 1摇
材料与试剂
苏丹红样品从市场获得
,
分别为苏丹红
玉、
域、芋、郁
粗样
。
苏丹红
玉、域、芋、郁
的
4
种化学
结构式
,
如图
1。
正己烷和乙腈
,
分析纯
,
国药集
团化学试剂有限公司
;
乙酸乙酯
,
分析纯
,
北京化
工厂
;
乙腈
,
色谱纯
, Fisher Scientific;
冰醋酸
,
色
谱纯
,
光复精细化工
;
纯水由
Millipore鄄Q
纯水机
自制
。
图
1摇
苏丹红
玉,域,芋
和
郁
的化学结构
Fig. 1摇 Chemical structures of Sudan玉,域,芋 and 郁
1郾 2摇
仪器与设备
1100
型高效液相色谱系统
(
配备在自动进样
器
,
四元梯度泵
,DAD
检测器
),
美国
Agilent
公司
;
DE鄄spectrum
型
(
柱体积
22郾 5 mL / 135 mL)、DE -MI鄄
DI
型
(
柱体积
1 000 mL)
高效逆流色谱仪
( high per鄄
formance countercurrent chromatography, HPCCC),
英
国
DE
公司
; Smart line 1 000
型和
Azura P2郾 1
型制
备液相系统
(
配逆流色谱仪
),
德国
KNANER
公司
;
AB135-S
型分析天平
,
瑞士
METTLER TOLEDO
公
司
;KQ-400DB
型超声波清洗仪
,
昆山市超声仪器
有限公司
;RE-2000
型旋转蒸发仪
,
上海亚荣公司
。
1郾 3
实验方法
采用
DE鄄spectrum
小体积逆流色谱仪进行溶剂
体系的筛选
,
再采用
DE鄄MIDI
大体积逆流色谱仪对
苏丹红
域
和
郁
两个样品进行分离纯化
,
并采用
HPLC
对纯化前后样品组分进行分析
。
1郾 3郾 1摇
高效液相色谱分析
经过不同流动相及梯度的优化
,
以
4
种苏丹红
的完全分离为目标
,
最终选定的色谱条件为
Agilent
ZOBAX SB-C18
色谱柱
(150 mm 伊 4郾 6 mm,5 滋m);
柱温
25 益;
流动相
V
(
渍
(
醋酸
) = 0郾 75%
水溶液
) 颐
V
(
乙腈
) = 0郾 5 颐 0郾 95,
等度洗脱
(0 ~ 13 min);DAD
检测波长
254,500,280 nm;
流速
1郾 0 mL / min;
进样
量
10 滋L。
采用上述条件对苏丹红
玉,域,芋
和
郁
的混合
样及苏丹红
域
和
郁
粗样进行分析
,
比较了其在不同
浓度和不同波长下检测时纯度的差异
。
并对纯化后
的样品纯度进行了检测
。
1郾 3郾 2 摇
逆流色谱分离
1郾 3郾 2郾 1摇
分离条件的选择
采用小体积的
DE鄄Spectrum HPCCC(
柱体积为
22郾 5 mL)
进行溶剂体系和条件的选择
。
根据苏丹
红的弱极性
,
首先实验了弱极性的
V
(
正己烷
) 颐
V
(
乙腈
) = 1颐 1
体系对苏丹红
域
和
郁
的纯化效果
,
后
对苏丹红
郁
的纯化采用了微调后的
V
(
正己烷
) 颐
V
(
乙腈
) 颐
V
(
乙酸乙酯
) = 5 颐 5 颐 1
体系
。
分离条件为
上样量
10 mg
溶解在
1 mL
流动相中
;
采用上述溶剂
体系
,
上相为固定相
,
下相为流动相
,
流速
1 mL / min;
转
速
1 400 r / min;
检测波长
500 nm。
1郾 3郾 2郾 2摇
半制备分离
采用
DE鄄Spectrum HPCCC(
柱体积为
135 mL)
进行半制备分离实验
。
上样量
60 mg
溶解在
2 mL
流动相中
;
溶剂体系同
1郾 3郾 2郾 1
节
,
上相为固定相
,
下相为流动相
,
流速
6 mL / min;
转速
1 400 r / min;
检
测波长
500 nm。
1郾 3郾 2郾 3摇
大制备量分离纯化
采用大体积的
DE鄄MIDI(
柱体积
1 000 mL)
对苏
丹红
域
和
郁
进行大量分离纯化
。
上样量
600 ~ 900
mg
溶解在
25 ~ 50 mL
的
1颐 1
的上下相混合液中
;
溶
剂体系同上
,
上相为固定相
,
下相为流动相
,
流速
45
mL / min(
苏丹红
域), 20 mL / min(
苏丹红
郁);
转速
1 100 r / min;
检测波长
500 nm。
对苏丹红
郁
还需进
行二次纯化
。
1郾 3郾 2郾 4摇
分离操作过程
每次分离前
,
将预先配制好的两相溶剂体系分
离
;
将上相作为固定相以较大的流速泵入逆流色谱
柱内
;
接着将仪器调至相应的转速
,
将下相作为流动
相以相应的流速泵入柱中
,
待柱后只有流动相流出
,
表明体系达到平衡
,
记录推出的固定相体积
,
计算固
定相保留率
S
f
,
并将样品注入进样环
;
然后用流动相
进行洗脱
,
根据检测器所检测到的色谱峰分段收集
流份
,
并用
HPLC
进行分析
。
最后将纯度相近的流
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食品科学技术学报
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摇 2016
年
5
月
