(Flavourzyme 500MG)
与碱性蛋白酶
(2郾 0 伊10
6
U / g),
诺维信生物技术有限公司
;
戊二醛
(25%
水溶液
),
中国医药
(
集团
)
上海化学试剂公司
;
其他试剂均为
国产分析纯
。
1郾 2摇
主要仪器
DHZ鄄D
型恒温振荡器
,
苏州培英实验设备有限
公司
;PHSJ鄄 4A
型
pH
计
,
上海雷磁仪器厂
; Spec鄄
trumlab S22
型可见分光光度计
,
上海棱光技术有限
公司
;JA1003
型电子天平
,
上海恒平科学仪器有限
公司
;
循环水式真空泵
,
巩义市予华仪器有限公司
。
1郾 3摇
实验方法
1郾 3郾 1摇
固定化风味蛋白酶的制备
固定化风味蛋白酶的制备采用交联壳聚糖
法
[12 - 13]
。
准确称取
2郾 5 g
壳聚糖
,
溶于
100 mL
体积
比为
2%
的冰乙酸溶液中
,
逐滴滴入
3%
的
NaOH
溶
液中
,
静置
2 h
使壳聚糖载体硬化
,
滤出并洗至中
性
,
再置于质量比为
0郾 5%
的戊二醛溶液中反应
6 h
进行交联
,
滤出并洗去戊二醛残液
,
即制得活化的壳
聚糖载体
。
将载体加入风味蛋白酶溶液中
,
于
4 益
固定化反应
12 h,
滤出并洗去残余酶液
,
即得固定化
风味蛋白酶
,
置于
4 益
冰箱中保存备用
。
风味蛋白
酶活力的测定采用福林酚法
(GB / T 23527—2009)。
1郾 3郾 2摇
大豆蛋白的水解
[
14
]
准确称取
10 g
大豆蛋白
,
置于
250 mL
具塞三角
瓶中
,
加入
90 mL
去离子水
,
搅匀
,90 益
水浴加热
5
min
使蛋白质适度变性
,
冷却后加入质量比为
1%
(
以大豆蛋白的质量计
)
的碱性蛋白酶
,
放入摇床中
于
55 益、150 r·min
- 1
水解
4 h,
然后加热至
90 益
并
保温
10 min
进行灭酶
。
酶解液真空抽滤
,
滤液采用
固定化风味蛋白酶继续水解
,
水解结束后
,
滤出固定
化风味蛋白酶
,
置于
4 益
冰箱中保存
,
以备重复使
用
,
滤液用于测定水解度
。
1郾 3郾 3摇
单因素实验
依次采用单因素实验设计对固定化风味蛋白酶
的水解温度
、pH
值
、
时间
、
加酶量等参数进行优化
,
即每次改变一个参数
,
分别在不同的水解温度
(35
~ 85 益)、pH
值
(6郾 5 ~ 9郾 0)、
时间
(1 ~ 10 h)、
加酶
量
(20 ~ 70 g / L)
等条件下按照
1郾 3郾 2
进行水解
,
并
测定水解度
,
以确定各参数的优化值
。
1郾 3郾 4摇
Box鄄Behnken
实验
在单因素实验的基础上
,
采用
Box鄄Behnken
实
验设计对固定化风味蛋白酶的水解时间
、
水解温度
和加酶量等
3
个主要因素进一步优化
。
利用
Design
Expert 8郾 0
软件进行实验设计和分析
,
实验因素及
其水平见表
1。
表
1摇 Box鄄Behnken
实验的因素与水平
Tab. 1摇 Experimental factors and levels of
Box鄄Behnken design
因素 代码
水平
- 1
0
1
时间
/ h
X
1
2
6
10
温度
/ 益
X
2
35
60
85
加酶量
/ (g·L
-1
)
X
3
20
45
70
1郾 3郾 5摇
水解度的测定
[
15
]
水解度
( degree of hydrolysis, DH)
是指水解过
程中蛋白质中肽键断裂的百分数
,
可通过测定水解
产物的
琢鄄
氨基氮含量进行计算
,
见式
(1)。
水解度
(DH) =
水解后生成的
琢鄄
氨基氮含量
样品的总含氮量
伊 100% 。 (1)
琢
鄄
氨基氮含量的测定采用茚三酮法
[16]
,
总氮含
量的测定采用凯氏定氮法
[17]
。
1郾 3郾 6摇
重复使用次数对固定化风味蛋白酶活力的
影响实验
在所优化的条件下
,
按
1郾 3郾 2
反复多次进行水
解实验
,
每次反应结束后
,
将固定化风味蛋白酶滤
出并洗净
,
重新置于新鲜的反应体系中进行下一次
水解实验
。
每次水解实验结束后
,
对固定化风味蛋
白酶进行酶活力测定
,
以评价其稳定性
。
2摇
结果与分析
2郾 1摇
水解温度对水解度的影响
水解温度对大豆肽水解度的影响结果如图
1。
由图
1
可见
,
温度在
35 ~ 65 益
变化时
,
水解度随着
温度的升高而增大
,
并在
65 益
时达到最大值
,
此后
再提高水解温度
,
水解度反而降低
,
但水解温度为
55 ~ 75 益
均能保持较高的水解度
,
这说明固定化风
味蛋白酶热稳定性较好
,
在工业应用中可承受较大
的温度波动
。
固定化风味蛋白酶水解大豆蛋白的最
适温度为
65 益,
这与李峰等
[18]
报道的游离风味蛋
白酶的最适温度
55 益
相比提高了
10 益,
其原因可
能是酶分子与载体结合后
,
热稳定性提高
,
热失活速
率下降
。
最适反应温度升高
,
使酶与底物结合频率
提高
,
水解速度加快
,
有利于提高工业生产效率
。
25
食品科学技术学报
摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
摇 2015
年
11
月
