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摇 摇 表 2摇 实时荧光 SPIA 设计的引物
Tab. 2摇 Real鄄time fluorescence SPIA primer design
引物名称 序列(5‘to3爷) 修饰
Pzrn2 GCUUAGUGA鄄TTTGATGGTGTC 5忆端 9nt 为 RNA,3忆端 12nt 为 DNA
Blocker2 TTAGATAATGTGGTA 3忆端用生物素修饰,中间随机加上 5 个 XNA 修饰
摇 摇 XNA,即 LNA,又称“ 锁核酸冶(Locked nucleic acid,LNA),是一种经过修饰的类寡核苷酸衍生物 ,包括 A,C,G,T,U,mC 六种碱基
贺氏菌、痢疾志贺氏菌在 XLD 琼脂培养基中进行划
线,培养箱 36 益 培养 12 h, 传代培养 2 次。 挑取传
代培养菌落接种至新鲜无菌的营养肉汤培养基中,
36 益 过夜培养。
1郾 2郾 2摇 基因组 DNA 的提取
1) 普通热裂解法。 取 1 mL 菌液 5 000 ~ 8 000
r / min,离心 5 min, 弃上清液。 加入 200 uL 无菌
DEPC 水, 振荡混匀,5 000 ~ 8 000 r / min, 离心 5 min,
弃上清, 重复操作一次。 加入 100 滋L 无菌 DEPC
水,振荡混匀,100 益 水浴 10 min,12 000 r / min 离心
10 min,取上清液, - 20 益 保存备用。
2) 天根试剂盒法。 按试剂盒说明书进行基因
组 DNA 的提取 ,并测定 DNA 浓度。
1郾 2郾 3摇 志贺氏菌实时荧光 SPIA 检测方法的建立
建立志贺氏菌实时荧光 SPIA 反应体系,总体积
为 25 滋L, 对反应体系中 RNA / DNA 组合引物、Bloc鄄
ker、 Bst DNA polymerase、 RNaseH、 dNTPs、 MgCl2 、
RNase Inhibitor 和 SYBER Green 域的使用浓度进行
优化,确定各组分的最佳工作浓度,建立志贺氏菌实
时荧光 SPIA 优化反应体系。
将志贺氏菌基因组 DNA 模板 、组合引物、Bloc鄄
ker 及反应缓冲液的混合液经 99 益,90 s 处理后降
温至 60 益,迅速加入 RNase H 和 Bst DNA 聚合酶,
在 ABI7500 实时荧光 PCR 仪上 55 ~65 益,反应 30 ~
60 min,反应过程中实时监测荧光信号,以期确定最佳
反应温度,建立志贺氏菌实时荧光 SPIA 检测方法。
1郾 2郾 4摇 志贺氏菌实时荧光 SPIA 检测方法的特异性
分析
取表 1 中 19 株过夜培养菌悬液 1 mL, 用热裂
解法提取基因组 DNA 作为模板,根据 1郾 2郾 3 中所建
立的反应体系和条件进行检测, 对所建立的实时荧
光 SPIA 方法进行特异性分析。
1郾 2郾 5 摇 两种基因组 DNA 提取方法对实时荧光
SPIA 检测结果的影响
使用 1郾 2郾 2 中两种方法提取 4 株不同群志贺氏
菌基因组 DNA, 每种方法各 3 个平行 , 作为模板进
行实时荧光 SPIA 检测,分析不同的 DNA 提取方法
对检测结果的影响。
1郾 2郾 6摇 志贺氏菌实时荧光 SPIA 检测方法的灵敏性
分析
以福氏志贺氏菌为检测对象, 对 1郾 2郾 3 中所建
立方法的灵敏性进行分析。 挑取营养琼脂上 36 益
培养 12 h 的福氏志贺氏菌单菌落, 制备成一定浓度
菌悬液。 用生理盐水进行 10 倍系列稀释, 采用稀
释平板法, 测定其纯培养物活菌数为 1郾 3 伊 108
CFU / mL; 同时取 1 mL 纯培养物采用试剂盒法提取
福氏志贺氏菌基因组 DNA, 测得 DNA 质量浓度为
116 mg / L,用灭菌 DEPC 水进行 10 倍系列稀释, 进
行志贺氏菌实时荧光 SPIA 方法的灵敏性试验。
1郾 2郾 7摇 志贺氏菌实时荧光 SPIA 检测方法在模拟样
品中检出限分析
在牛奶中添加福氏志贺氏菌作为模拟污染样品
进行检出限分析。 进行添加前 , 牛奶样品已按 GB
4789郾 5—2012[6] 常规检验法证实志贺氏菌阴性 。 挑
取在营养琼脂 36 益 培养 12 h 的福氏志贺氏菌单菌
落 ,制备成一定浓度菌悬液, 用生理盐水进行 10 倍
系列稀释后 ,选取系列稀释浓度菌悬液 1 mL 分别添
加到 99 mL 牛奶样品中,混匀 ,分别取 1 mL 模拟样品,
采用稀释平板法, 测定其活菌添加范围为 1郾 8 伊 105 ~
1郾 8 伊 10 - 2 CFU / mL,直接用热裂解法提取志贺氏
菌基因组 DNA, 进行志贺氏菌实时荧光 SPIA 方法
对模拟污染牛奶样品的检出限分析。 本实验重复
3 次 。
2摇 结果与分析
2郾 1摇 志贺氏菌实时荧光 SPIA 反应体系和反应条
件的建立
通过对反应体系 、反应条件 、 组合引物及 Bloc鄄
ker(Pzrn 2 + Blocker 2) 的优化 , 志贺氏菌出现典型
的扩增曲线, 如图 1。 最终确定反应条件为 59郾 0
益,1 s;58郾 0 益,32 s;80 个循环 ,反应时间为 44 min。
反应体系为 RNA / DNA 组合 Primer 5郾 6 滋mol / L、
24 食品科学技术学报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 2015 年 11 月