201506 - page 48

Blocker 0郾 36 滋mol / L、 10 伊 Bst Buffer 2郾 5 滋L、 Bst
DNA polymerase 20 U、10 伊 RNaseH Buffer 2郾 5 滋L、
RNaseH 5 U、dNTPs 0郾 2 mmol / L、MgCl2 3郾 5 mmol / L、
RNase Inhibitor 16 U、DNA 模板 1 滋L、SYBER Green 域
0郾 3 滋L(300 伊 稀释),其余用灭菌 DEPC 水补足体系。
1郾 Pzrn 2 + Blocker 2; 2郾 DEPC H2 O
图 1摇 Pzrn 2 和 Blocker 2 的实时荧光 SPIA 反应结果
Fig. 1摇 Results of real鄄time fluorescence SPIA with
Pzrn 2 Primer and Blocker 2
2郾 2摇 志贺氏菌实时荧光 SPIA 检测方法的特异性
分析
建立的志贺氏菌实时荧光 SPIA 检测方法具有
良好的特异性,检测结果如图 2。 由图 2 可见,4 株
志贺氏菌均出现典型的荧光扩增曲线,其他细菌检
测均未产生扩增曲线。
1. 福氏志贺氏菌; 2. 鲍氏志贺氏菌; 3. 宋内志贺氏菌 ; 4. 痢疾志
贺氏菌; 5. 单核细胞增生李斯特氏菌 ; 6. 鼠伤寒沙门氏菌; 7. 大
肠埃希氏菌 O157:H7; 8. 蜡样芽孢杆菌; 9. 小肠结肠炎耶儿森氏
菌; 10. 大肠埃希氏菌; 11. 金黄色葡萄球菌; 12. 弗氏柠檬酸杆
菌; 13. 粪肠球菌; 14. 乙型溶血性链球菌; 15. 地衣芽孢杆菌 ;
16. 恶臭假单胞菌
图 2摇 志贺氏菌实时荧光 SPIA 引物特异性检测结果
Fig. 2摇 Specificity of real鄄time fluorescence
SPIA for Shigella
2郾 3摇 不同模板 DNA 提取方法对志贺氏菌实时荧
光 SPIA 检测结果的影响
分别用热裂解法、试剂盒法提取志贺氏菌模板
DNA,应用实时荧光 SPIA 检测, 每种方法各做 3 个
平行实验,均出现典型的扩增曲线, C t 值没有明显
差异,结果如表 3。 表 3 表明 , 实时荧光 SPIA 方法
检测志贺氏菌对模板质量要求不苛刻, 能适应广大
的基层和现场检测。
表 3摇 不同模板 DNA 提取方法对志贺氏菌
实时荧光 SPIA 检测结果的影响
Tab. 3摇 Effects of different DNA extraction methods on
results of real鄄time SPIA for Shigella
细菌名称
平均 C t 值
热裂解法 试剂盒法
福氏志贺氏菌 49郾 40 46郾 37
鲍氏志贺氏菌 53郾 27 48郾 70
宋内志贺氏菌 51郾 00 50郾 82
痢疾志贺氏菌 52郾 36 50郾 16
2郾 4摇 志贺氏菌实时荧光 SPIA 检测方法的灵敏度
分析
根据 2郾 1 建立的实时荧光 SPIA 检测方法,进行
志贺氏菌实时荧光 SPIA 检测方法的灵敏性实验,结果
如图 3。 由图 3 可见,当 DNA 模板用量为 1郾 16 伊10 3 ~
1郾 16 fg / 滋L 时, 即志贺氏菌浓度为 1郾 3 伊 10 3 ~ 1郾 3
CFU / mL 时 ,均出现典型的扩增曲线; 当模板用量为
0郾 116 fg / 滋L,即志贺氏菌浓度为 0郾 13 CFU / mL 时 ,
则无扩增曲线。 因此, 志贺氏菌 DNA 的检测灵敏度
为 1郾 16 fg / 滋L, 对志贺氏菌菌液的检测灵敏度为 1郾 3
CFU / mL。
DNA 模板用量 / ( fg·滋L -1 ) 1. 1郾 16 伊 103 ; 2. 1郾 16 伊 102 ; 3.
1郾 16 伊 10 1; 4. 1郾 16; 5. 0郾 116; 6. DEPC H2 O
图 3摇 志贺氏菌实时荧光 SPIA 检测方法的
灵敏性实验结果
Fig. 3摇 Sensitivity of real鄄time fluorescence
SPIA detection of Shigella
2郾 5摇 志贺氏菌实时荧光 SPIA 检测方法在牛奶模拟
样品中的检出限分析
根据 2郾 1 建立的实时荧光 SPIA 检测方法,进行
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第 33 卷 第 6 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 王建昌等: 志贺氏菌实时荧光单引物等温扩增方法的建立及应用