第 卷 第 期
2015
年
11
月
食 品 科 学 技 术 学 报
Journal of Food Science and Technology
Nov. 2015
doi:10. 3969 / j. issn. 2095鄄6002. 2015. 06. 007
文章编号
:
2095鄄6002(2015)06鄄0040鄄06
引用格式
:
王建昌
,
胡连霞
,
段永生
,
等
.
志贺氏菌实时荧光单引物等温扩增方法的建立及应用
[ J].
食品科学技术学报
,
2015,33(6):40 - 45.
WANG Jianchang, HU Lianxia, DUAN Yongsheng, et al. Establishment and application of real鄄time fluorescence single
primer isothermal amplification for
Shigella
[J]. Journal of Food Science and Technology, 2015,33(6):40 - 45.
志贺氏菌实时荧光单引物等温扩增方法的建立及应用
王建昌
,
胡连霞
,
段永生
,
李
摇
静
,
王金凤
*
(
河北出入境检验检疫局 检验检疫技术中心
,
河北 石家庄
050051
)
摘
摇
要
:
以志贺氏菌
ipaH
基因特异序列为靶序列
,
设计
RNA鄄DNA
组合引物和链终止序列
,
优化反
应体系
,
建立实时荧光单引物等温扩增检测志贺氏菌的方法
,
反应时间为
44 min
。
通过对
4
株不同
群志贺氏菌和
12
株其他食源性致病菌进行实时荧光单引物等温扩增检测
,
结果表明
,
除
4
株志贺
氏菌外
,
其他细菌均未扩增出荧光曲线
。
进一步研究表明
,
采用普通热裂解法提取
DNA
,
实时荧光
检测福氏志贺氏菌
DNA
的灵敏度为
1郾 16 fg / 滋L
,
纯培养菌液的灵敏度为
1郾 3 CFU / mL
;
对牛奶模拟
样品中福氏志贺氏菌的检出限是
1郾 8 CFU / mL
。
研究结果表明
,
实时荧光单引物等温扩增检测志贺
氏菌灵敏度高
、
特异性强
、
耗时短
、
方法简便
。
关键词
:
实时荧光单引物等温扩增
;
志贺氏菌
;
ipaH
基因
中图分类号
:
TS207郾 4
;
R117摇 摇 摇 摇 摇
文献标志码
:
A
收稿日期
: 2015 03 04
基金项目
:
质检公益性科研专项项目
(201210128;201310126)。
作者简介
:
王建昌
,
男
,
兽医师
,
博士
,
主要从事食源性微生物
、
动物疫病病原分子生物学研究
;
*
王金凤
,
女
,
兽医师
,
硕士
,
主要从事食源性微生物
、
动物疫病病原分子生物学研究
。
通信作者
。
摇 摇
志贺氏菌
(
Shigella
)
是人类细菌性痢疾最为常
见的病原菌
,
通称痢疾杆菌
,
是一类具有高度传染性
和危害严重的革兰氏阴性杆菌
,
长约
2 ~ 3 滋m,
不形
成芽孢
,
无荚膜
,
无鞭毛
,
有菌毛
。
志贺氏菌病常为
食物爆发型或经水传播
[1]
,
人类对志贺氏菌普遍易
感
,
每年全球有
1郾 6
亿人患病
,
约有
110
万人死亡
,
绝大多数为
5
岁以下儿童
[2]
,10 ~ 100 CFU / mL
细菌
即可致病
[3]
。
在发展中国家
,
由福氏志贺氏菌引起
的感染性腹泻疾病高居首位
[4]
。
中国自
2005
年开
始
,
在全国范围内开展菌痢的监测
,
该病的报告病例
数一直高居全国甲乙类法定传染病的前
5
位
[5]
。
目前
,
食品中志贺氏菌的传统检测方法主要依
据国家标准
GB 4789郾 5—2012
[6]
,
需要厌氧培养
、
分
离
、
筛选和生化鉴定
,
检测结果虽准确
,
但操作烦琐
、
检测周期长
,
满足不了快速检测的需求
。
分子生物
学技术因具有检测灵敏度高
、
特异性强
、
操作简便等
优点
,
在食源性致病菌的检测中发挥了巨大的作用
,
也被应用于志贺氏菌的检测
。
随着食品安全检测标
准的提高
,
寻找更加快速
、
准确
、
便捷的检测技术显
得至关重要
。
志贺氏菌属分为痢疾志贺氏菌
(
S. dysenteriae
)、
福
氏志贺氏菌
(
S. flexneri
)、
鲍氏志贺氏菌
(
S. boy dii
)
和宋
内氏志贺氏菌
(
S. sonnei
)4
个群
。
编码侵袭性质粒相关
抗原
H
的片段基因
(ipaH),
决定志贺氏菌对大肠黏膜
的上皮细胞侵袭能力
,
同时
,
多拷贝存在于染色体和侵
袭性大质粒上
,
不随传代而丢失
。
以志贺氏菌
ipaH
基
因保守序列为靶基因可将其与其他致病菌种属区分
开
,
又可以全部检测出志贺氏菌
4
个群
。
单引物等温扩增技术
( single primer isothermal
amplification, SPIA)
是近年报道的一种新型线性核
酸等温扩增技术
。
该技术主要是通过一条
3爷
端是
DNA
片段
、5爷
端是
RNA
片段的组合引物
、RNase H
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