及具有强链置换活性的
DNA
聚合酶实现
DNA
的体
外线性等温扩增
,
经过
RNA
降解
、
新引物结合
、
链置
换的循环过程
,
实现模板互补序列的快速扩增
,
最终
扩增出大量的具有高度忠实性的
cDNA
单链
[7 - 8]
。
目前
,
国内外关于
SPIA
方法的报道比较少
,
利
用实时荧光
PCR
仪进行实时监测
,
建立实时荧光
SPIA
检测志贺氏菌方法
,
更未见到报道
。 Potash
等
[9]
曾应用逆转录
SPIA
技术研究从生物样品中扩
增全基因组
cDNA,
并对重组病毒
EcoHIV
感染小鼠
后感染应激基因进行了成功表达
。 Whitworth
等
[10]
在分析猪胚胎不同发育阶段基因表达差异时
,
应用
美国
NuGEN
公司开发的
Ribo鄄SPIA
试剂盒进行了
mRNA
的扩增和转录
。
该
Ribo鄄SPIA
试剂盒能够从
低至
1ng
的总
RNA
模板中扩增出
10
6
的
cDNA
产
物
。
而本研究运用
SPIA
技术基本原理
,
针对志贺氏
菌
ipaH
基因保守序列设计特异性的
RNA / DNA
组
合引物和终止序列
Blocker,
并在反应体系中加入特
异性结合单链
DNA
的
Sybergreen 域
荧光染料
,
建立
检测志贺氏菌的实时荧光单引物等温扩增
( real鄄
time SPIA)
方法
,
与实时荧光
PCR
方法相比
,
该方法
灵敏度高
,
对模板质量要求不高
,
扩增时间短
,
适合
于食品中致病菌现场快速筛选
。
1摇
材料和方法
1郾 1摇
材料
1郾 1郾 1摇
实验菌株
本实验所用菌株见表
1。
表
1摇
实验用菌株
Tab. 1摇 Strains in this study
菌株编号
菌种名称
菌种来源
1
福氏志贺氏菌
(
Shigella flexneri
)
CICC21678
2
宋内志贺氏菌
(
Shigella sonnei
)
CICC21679
3
鲍氏志贺氏菌
(
Shigella boydii
)
CICC 21680
4
痢疾志贺氏菌
(
Shigella dysenteriae
)
CICC 10983
5
单核细胞增生李斯特氏菌
(
Listeria monocytogenes
)
ATCC19114
6
鼠伤寒沙门氏菌
(
Salmonella typhimurium
)
CICC22956
7
大肠杆菌
O157:H7(
Escherichia coli
O157:H7)
CICC21530
8
蜡样芽孢杆菌
(
Bacillus cereus
)
CICC10468
9
小肠结肠炎耶儿森氏菌
(
Yersinia enterocolitica
)
CICC21609
10
大肠埃希氏菌
(
Escherichia coli
)
CMCC44102
11
金黄色葡萄球菌
(
Staphyloccocus aureus
)
ATCC6538
12
弗氏柠檬酸杆菌
(
Citrobacter freundii
)
ATCC 10787
13
粪肠球菌
(
Enterococcus faecalis
)
ATCC 29212
14
乙型溶血性链球菌
(
Streptococcus hemolytic鄄茁
)
CMCC10373
15
地衣芽孢杆菌
(
Bacillus licheniformis
)
ATCC 21424
16
恶臭假单胞菌
(
Pseudomonas putida
)
ATCC 17485
摇 摇 ATCC,
美国典型菌种保藏中心
;CICC,
中国工业微生物菌种保藏管理中心
;CMCC,
中国医学微生物菌种保藏管理中心
1郾 1郾 2摇
主要试剂
BstDNA
聚合酶
、 RNase H、 RNA
酶抑制剂
、
MgCl
2
、dNTPs、SYBER Green 域
等
,
购自上海生工生
物工程有限公司
;
基因组
DNA
提取试剂盒
,
购自北
京天根生化科技有限公司
;
实验中所有培养基均购
自北京陆桥有限责任公司
;
实验中所用到的牛奶样
品购自当地超市
。
1郾 1郾 3摇
主要设备
ABI7500
型扩增仪
,
美国
AB
公司
;Whatman T
Gradient
基因扩增仪
,
德国
Biometra
公司
; Biopho鄄
tometer plus
核酸蛋白分析仪
,
德国
Eppendorf
公司
。
1郾 1郾 4摇
RNA / DNA
组合引物和
Blocker
的设计和合成
根 据
Genebank
中 志 贺 氏 菌
ipaH
基 因
(EU340151)
已知序列
,
对其进行同源性分析
,
确定
其保守序列
,
用
Primer Premier 5郾 0
设计组合引物和
相应链终止序列
,
如表
2。
所有组合引物和
Blocker
均由大连
Takara
公司合成
。
1郾 2摇
实验方法
1郾 2郾 1摇
志贺氏菌的培养
取保藏的福氏志贺氏菌
、
宋内志贺氏菌
、
鲍氏志
14
第
33
卷 第
6
期
摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
王建昌等
:
志贺氏菌实时荧光单引物等温扩增方法的建立及应用
