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牛奶模拟样品的检出限分析, 结果如图 4。 由图 4
可见,当牛奶样品中志贺氏菌浓度为 1郾 8 CFU / mL
时,出现典型的扩增曲线 ;当牛奶样品中志贺氏菌浓
度为 0郾 18 CFU / mL 时, 则无扩增曲线。 因此 , 志贺
氏菌实时荧光 SPIA 检测方法在牛奶模拟样品中检
出限为 1郾 8 CFU / mL。 3 次重复实验结果一致。
志贺氏菌浓度 / (CFU·mL -1 ) 1. 1郾 8 伊 103; 2. 1郾 8 伊 102; 3. 1郾 8 伊
10 1; 4. 1郾 8; 5. 0郾 18
图 4摇 志贺氏菌实时荧光 SPIA 检测方法对模拟样品
中志贺氏菌的检出限分析结果
Fig. 4摇 Detection limit of real鄄time fluorescence SPIA
detection of Shigella in simulated sample
3摇 结摇 论
志贺氏菌属的菌群分布在各地之间存在差异,
在同一地区的不同年份其菌群分布也不尽相同。 国
外在 20 世纪 40 年代以前是 A 群占优势 ,50 年代以
B 群为主, 而 1965 年后 D 群为主要菌群。 自 2005
年以来,我国大部分省市分离的志贺氏菌以福氏志
贺氏菌为主, 而从 2010—2011 年的监测数据来看,
宋内志贺氏菌成了优势菌群, 检出率分别为
70郾 59% 和 67郾 86% ,远远超过福氏志贺氏菌[11] 。 以
志贺氏菌属 ipaH 基因 4 个群保守序列,设计组合引
物和链终止序列,建立的实时荧光 SPIA 检测方法对
志贺氏菌属的 4 个群均能检出,检测灵敏度较高, 同
时对模板 DNA 要求较低, 能够满足各个地区和国家
普及和推广。
Igor 等 [12] 研究发现,10 ~ 100 CFU / mL 的志贺
氏菌就可引发严重的炎症反应, 引起幼儿急性中毒
性菌痢,而且死亡率高。 我国吴平芳等[13] 建立的改
良分子信标- 实时 PCR 反应体系, 对志贺氏菌 DNA
灵敏度为 93 fg / 滋L,对其菌液灵敏度为 64 CFU / mL。
胡建华等[14] 对培养液中及牛奶阳性样品中的志贺
氏菌采用常规 PCR 和实时定量 PCR 相结合进行检
测 ,在 20 h 内检测敏感度可达到 2 CFU / mL。 曾桂
芬等[15] 所建立的志贺氏菌 LAMP 检测方法, 对细菌
纯培养物和模拟食品的灵敏度分别为 53, 68
CFU / mL。本研究所建立的志贺氏菌实时荧光 SPIA
方法, 对志贺氏菌纯培养的灵敏度为 1郾 3 CFU / mL,
对牛奶模拟污染样品的检出限是 1郾 8 CFU / mL。 因
此 ,灵敏性和检出限要高于实时荧光 PCR 和 LAMP
方法。
本研究依据 SPIA 的原理,在普通 SPIA 的基础
上 ,采用加入特异性结合单链 DNA 的荧光染料
SYBER Green域,利用荧光 PCR 仪进行实时监测扩
增情况 ,建立了实时荧光 SPIA 检测方法。 本方法省
去烦琐的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测过程, 比普通
SPIA 技术和 PCR 技术省时省力, 成为可以替代
PCR 的核酸扩增新技术。 本研究所建立的实时荧
光 SPIA 方法反应时间仅为 44 min,对志贺氏菌纯培
养的灵敏度为 1郾 3 CFU / mL, 在检测牛奶模拟污染
样品时其检出限是 1郾 8 CFU / mL, 比 LAMP 法对志
贺氏菌灵敏度和检出限高 1 个数量级, 且对模板
DNA 质量要求不高, 所以易于在基层和现场快速
检测。
随着对 SPIA 技术研究的不断深入, 我们将不断
完善、发展这种新型的技术 ,使之在食源性致病菌检
测方面发挥更大优势 ,得到更全面的应用 。 单引物
等温扩增技术在食源性致病菌的快速检测方面将具
有广阔的应用前景。
参考文献:
[1]摇 Fan He, Ke Han, Lunguang Liu, et al. Shigellosis out鄄
break associated with contaminated well water in a rural
elementary school: Sichuan Province, China, June 7 -
16, 2009 [J]. PLoS One, 2012, 7(10): e47239.
[2]摇 Ashkenazi S. Shigella infections in children: new insights
[J]. Seminars in Pediatric Infectious Diseases, 2004, 15
(4): 246 - 252.
[3]摇 Kotloff K L, Winickoff J P, Ivanoff B, et al. Global bur鄄
den of Shigella infections:implications for vaccine devel鄄
opment and implementation of control strategies[J]. Bull
World Health Organ, 1999, 77(8): 651 - 666.
[4]摇 Bhattattacharya D, Suqunan A P, Bhattacharjee H, et
al. Antimicrobial resistance in Shigella鄄rapid increase &
widening of spectrum in Andaman Islands, India[ J]. In鄄
dian Joural of Medical Research, 2012, 135(3): 365 -
370.
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