固定化柚苷酶
。
并选出较佳的材料进行固定化条件
优化
,
为固定化柚苷酶的应用发展提供研究基础
。
1摇
材料与方法
1郾 1摇
材料与试剂
柚苷酶
,CAS
号
9068鄄31鄄9,369 U / g;
柚皮苷
,
经
HPLC
检测纯度为
98% ,
美国
Sigma鄄Aldrich
公司
;
考马斯亮蓝
G鄄250,
北京鼎国昌盛生物技术有限责
任公 司
;
壳 聚 糖
(
脱 乙 酰 度
逸 95郾 0% ), Ruibio
C4415,Reagent Grade;
一缩二乙二醇
(diethylene gly鄄
col,DEG) (
化学纯
) 、
活性炭
、
氧化石墨烯
,
国药集
团化学试剂有限公司
;
其他化学试剂均为分析纯
。
1郾 2摇
仪器与设备
雷磁
PHS鄄3C
型
pH
计
,
上海仪电科学仪器股份
有限公司
;Epoch
超微量微孔板分光光度计
,BioTek
Instruments
公司
;FA2004
型电子天平
,
上海舜宇恒
平科学仪器有限公司
;SC鄄15A
型电热恒温水浴锅
,
宁波是海曙天恒仪器厂
;DHG鄄9070A
型电热恒温鼓
风干燥箱
,
上海一恒科技有限公司
;Anke TGL鄄16G鄄
A
型冷冻离心机
,
上海安亭科学仪器厂
。
1郾 3摇
实验方法
1郾 3郾 1摇
载体的制备
活性炭和氧化石墨烯直接固定化
,
无需制备成
微球
。
1郾 3郾 1郾 1摇
壳聚糖微球的制备
称取
3郾 5 g
壳聚糖
,
用
100 mL
渍
(
醋酸
) = 2郾 0%
的水溶液溶解
,
配制成
籽
(
壳聚糖
) = 3郾 5 g / 100 mL
的胶体溶液
,
并将溶液超声处理
20 min,
驱除气泡
、
使其充分溶解
。
在另一烧杯中配制一定质量浓度的
NaOH
和乙醇混合凝结液
1 000 mL。
用
10 mL
的注
射器吸取壳聚糖胶体溶液
,
逐滴滴入上述凝结液中
制成微球
,
滴加完后于室温
(25 益)
条件下放置
3 h,
用去离子水反复洗涤壳聚糖微球直至中性
,
再用蒸
馏水冲洗
3
次
,
抽干
,4 益
冷藏备用
[3 - 10]
。
凝胶化的
壳聚糖微球表面含有丰富的氨基基团
,
以共价键结
合的方式
,
可以得到稳定的固定化酶
,
外界条件的改
变不易导致酶分子的脱落
[11]
。
1郾 3郾 1郾 2摇
海藻酸钠微球的制备
制备方法同壳聚糖微球的制备
,
只是将凝结液
变为一定质量浓度的
CaCl
2
溶液
。
在注射器推动力
和电场力作用下
,
原料液滴入低温
CaCl
2
溶液
,
迅速
固化
,
形成海藻酸钙凝胶微球
,
浸泡
,
清洗
,
真空避
光
,
室温干燥
[12]
。
1郾 3郾 2摇
不同材料固定化柚苷酶
分别称取不同质量的载体材料
(
壳聚糖
、
海藻
酸钠微球
1郾 0 g,
活性炭过
120
目筛且取
0郾 5 g,
氧化
石墨烯取
0郾 05 g),
加入到
4 mL 1郾 0 mg / mL
的柚苷
酶酶液
(pH 4郾 0,0郾 2 mol / L
醋酸缓冲液
)
中
,25 益
恒
温振荡
(180 r / min)2 h,4 益
冰箱中吸附
6郾 0 h。
再用
pH 4郾 0
的醋酸缓冲液洗去固定化酶表面游离酶
,
收
集游离酶液
。
即得到固定化柚苷酶
,4 益
冰箱保存
。
1郾 3郾 3摇
固定化柚苷酶活力的测定
采用中林改良
Davis
法
[13 - 14]
。
利用柚皮苷在
碱性条件下及
40益
温度中
,
能与一缩二乙二醇发生
反应
。
柚皮苷起显色反应
(
黄色
),
生成一种叫柚皮
苷二氢查尔酮的物质
。
利用此反应
,
可以配制出柚
皮苷的标准溶液
,
并绘制出标准曲线
。
柚苷酶活力测定
。
取
2 mL
柚苷标准溶液
400
滋g / mL
和
0郾 2 mol / L
的
pH 4郾 0
醋酸缓冲液
2 mL
置
于试管中
,
在
40 益
恒温摇床中预热
4 ~ 5 min,
然后
向该试管置入
0郾 1 g
固定化柚苷酶
,
保温
30 min,
再
置沸水中
5 min
终止酶活
,
取该反应液通过超微量
微孔板分光光度计分析柚苷含量
,
计算酶活
。
固定化柚苷酶活力的定义为在
40 益,pH 4郾 0
条件下
,
每分钟每克固定化酶分解柚皮苷的微克数
表示为一个酶活力
[15]
,
单位
U。
1郾 3郾 4摇
固定化柚苷酶载酶率的测定
采用考马斯亮蓝测蛋白的方法
[16 - 17]
。
所有材
料固定化柚苷酶后
,
所收集的游离酶液用
pH 4郾 0
醋
酸缓冲液定容至
10 mL,
同时取
4 mL 1郾 0 mg / mL
的
标准柚苷酶酶液同样定容至
10 mL,
在
590 nm
处用
考马斯亮蓝法测蛋白含量
。
根据不同材料固定后剩
余游离柚苷酶与未固定化标准柚苷酶计算出不同材
料固定化柚苷酶的载酶率
。
2摇
结果与分析
2郾 1摇
不同载体对固定化柚苷酶的影响
2郾 1郾 1摇
固定化柚苷酶酶活的比较
壳聚糖和海藻酸钠分别以微球的形式吸附柚苷
酶
,
酶活分别达到
14郾 34 U / g
和
12郾 18 U / g,
活性炭
也具有较强的吸附能力
,
其固定化酶活达
20郾 50 U / g,
而氧化石墨烯由于有较大的比表面积和非共价键的
吸附方式既可以稳定地固定化柚苷酶
,
又可在反应
时逐步释放柚苷酶分子
,
其固定化酶活高达
410郾 50
44
食品科学技术学报
摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
摇 2015
年
5
月
