株在麦粒培养物上产生的
VOCs
对串珠镰刀菌菌落
生长直径的抑制作用与该菌株麦粒培养物的质量呈
正效应关系
,
随着培养皿内麦粒培养物质量的增加
,
其菌落直径逐渐减小
,
在
16 g /
皿时
,
串珠镰刀菌的
菌饼
5 d
未见生长
[8 - 9]
。
基于前期研究基础
,
本研
究继续对白黄链霉菌
TD-1
菌株产生的
VOCs
对灰
霉孢菌的抑菌活性及抗菌物质进行研究
,
为将其研
发成高效
、
安全
、
环保的微生物熏蒸剂奠定基础
。
1摇
材料与方法
1郾 1摇
供试菌株
白黄链霉菌
TD -1(
S. alboflavus
TD -1),
本实
验室自天津市宝坻区饲料厂储粮仓附近土样中筛选
并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生
物中心
(
编号
:CGMCC No. 4666)。
Botrytis cinerea
,
由天津市畜牧兽医研究所提供
。
1郾 2摇
培养基
链霉菌
TD - 1
活化培养基
:
高氏一号固体培
养基
。
链霉菌
TD-1
种子培养基
:
葡萄糖
65郾 0 g,
黄豆
粉
10郾 0 g,KNO
3
0郾 5 g,MgSO
4
·7H
2
O 1郾 0 g,K
2
HPO
4
1郾 0 g,NaCl 0郾 5 g,KCl 0郾 2 g,FeSO
4
·7H
2
O 0郾 01 g,
自
来水
1 000郾 0 mL,pH
值
7郾 2。
灰霉孢菌培养基
:PDA
培养基
。
1郾 3摇
链霉菌
TD-1
种子液及麦麸培养物的制备
将
TD-1
菌株划线接种于高氏一号固体培养基
上进行活化
,30 益
培养
5 ~ 6 d
后制备成
10
6
~ 10
8
CFU / mL
孢子悬液
,
按
1%
体积比接种于链霉菌种
子培养基中
,30 益、180 r / min
摇床培养
2 d,
得链霉
菌
TD-1
种子液
。
取
20 g
麦麸置于
250 mL
锥形瓶内
,
按质量比
1颐 1
加入自来水
,121 益、20 min
灭菌
。
接种
4郾 0 mL
链霉菌种子液于麦麸上
,30 益
下培养
8 d。
1郾 4摇
灰霉孢菌菌饼的制备
取在
PDA
培养基上培养
7 d
的灰霉孢菌
,
无菌
水洗下孢子
,8
层纱布过滤
,
制成孢子浓度为
10
6
~
10
8
CFU / mL
的孢子悬液
。
取
1 mL
加入到
10 mL
约
40 益
的
PDA
培养基中
,
摇匀后倒入培养皿中
,
培养
基冷却后
,
用打孔器打孔
,
得到直径
6 mm
的灰霉孢
菌菌饼
。
1郾 5摇
链霉菌
TD-1 VOCs
抑菌活性的测定
采用双皿对扣法测定
TD-1
菌株
VOCs
的抑菌
活性
[10]
。
取
2
个直径为
90 mm
的培养皿的皿底
,
一
个倒入
15 mL PDA
培养基
,
冷却后将灰霉孢菌菌饼
置于培养基中央
,
另一个放置
6郾 0 g TD-1
菌株麦麸
培养物
。
将有灰霉孢菌菌饼的皿底对扣于含麦麸培
养物的皿底上
,
封口膜封口
,
以含有相同质量的无菌
麦麸培养皿为空白对照
,30 益
培养
5 d
后
,
采用十字
交叉法测定处理组及空白组灰霉孢菌菌落直径
,
并
用式
(1)
计算
TD-1
菌株
VOCs
的抑菌率
。
抑菌率
=
(
空白组菌落直径
-
实验组菌落直径
)
空白组菌落直径
伊 100% 。
(1)
1郾 6摇 VOCs
对灰霉孢菌产孢能力及菌丝形态的影
响实验
1郾 5
中双皿对扣法培养结束后
,
采用血球板计
数各组中灰霉孢菌的孢子数
,
并在扫描电镜下观察
灰霉孢菌的菌丝形态
。
1郾 7摇 VOCs
对灰霉孢菌细胞膜通透性的影响实验
按
1郾 5
中的双皿对扣法
,
下层皿底为
TD -1
麦
麸培养物
,
上层皿底倒入
PDA
培养基
,
冷却后平铺
无菌玻璃纸
(1郾 5 cm 伊 1郾 5 cm)。
将
0郾 5 mL
孢子悬
液均匀涂布于玻璃纸上
,
以等质量的无菌麦麸为空
白对照
,
封口膜密封
,30 益
培养一定时间后
,5 mL
无
菌水洗下菌体
,
离心
,
分光光度计测定上清液
OD
260
值
[11]
。
1郾 8摇 VOCs
的
GC / MS
分析鉴定
链霉菌
TD-1
麦麸培养物培养
8 d
后
,
其
VOCs
用顶空固相萃取法收集后利用
GC / MS
分析检
测
[8]
,
检测条件如下
。
气相色谱条件
:VF -5MS
型色谱柱
(30 m 伊 0郾 25
mm 伊 0郾 25 滋m),
进样口温度
250 益。
载气
He
纯度
99郾 999% ,
分流比
10颐 1,
流速
1 mL / min,
程序升温
,
初
始温度
40 益(
保持
3 min),
以
4 益 / min
升至
150 益
(
保持
1 min),
以
8 益 / min
升至
250 益 (
保持
6
min),
根据气相色谱峰面积归一法确定各组分
含量
。
质谱条件
:EI
离子源
,
电离能量
70 eV,
离子阱
温度
220 益,
传输线温度
280 益,
溶剂延迟时间
1郾 5
min。
全扫描方式
,
扫描范围
43 ~ 500 m / z,
检索谱库
NIST05。
1郾 9摇
数据统计与分析
利用
SPSS
统计分析软件
( Version 13郾 0, SPSS
Inc郾 , Chicago, USA)
对各项数据进行分析
。
用最小
74
第
34
卷 第
3
期
摇 摇 摇 摇 摇 摇
李贞景等
:
白黄链霉菌
TD-1
菌株挥发性有机物对灰霉孢菌的抑制作用
