食品科学技术学报201504 - page 23

1郾 3郾 5摇 不同缓冲体系中 ana鄄rLOX 的高分辨率熔解
分析
在 96 孔板中 ,将不同缓冲体系的 ana鄄rLOX 与
罗氏染料混合,采用 LightCycler襆 480 系统进行熔解
曲线分析,得到熔解温度 Tm 。
1郾 3郾 6摇 不同缓冲体系对 ana鄄rLOX 构象的影响实验
采用圆二色谱法, 分别用 pH 值为 4,5,6,7,8,
9,10(0郾 05 mol / L PBS 缓冲液以及 Tris鄄HCl 缓冲液)
的缓冲液将酶液稀释 10 倍, 加入相对应 pH 值的底
物, 在 25 益 下 ,测定 ana鄄rLOX 在不同 pH 值条件下
的二级结构的变化。
1郾 3郾 7摇 实验设计与数据处理
实验结果使用 SAS 软件进行方差和显著性分
析( p < 0郾 05)。
2摇 结果与分析
2郾 1摇 ana鄄rLOX 的最适反应 pH 值及 pH 值稳定性
分析
将酶置于不同 pH 值的缓冲液体系中, 其余条
件不变, 测定 ana鄄rLOX 的活性,结果如图 1。 由图 1
可见,当 pH 值在 4 ~ 10 时 ,ana鄄rLOX 的酶活力呈先
上升后下降的趋势;当 pH 值大于 9 以后, 酶活力急
剧下降, 当 pH 值为 10 时, 酶活力相对于 pH 值为 9
时, 降至 5% ;当 pH 值为 7 ~ 9 时,酶活力迅速升高。
当 pH 值为 9 时, 酶活达到最大值 5郾 59 伊 104 U / mL,
因此该酶的最适反应 pH 值为 9。
图 1摇 ana鄄rLOX 最适反应 pH 值
Fig 1摇 Effect of pH on activity of ana鄄rLOX
将 ana鄄rLOX 置于不同 pH 值的缓冲体系中,4
益 放置 5 h 后测定剩余酶活力, 以未经处理的酶活
力为 100% ,结果如图 2。 图 2 结果显示,ana鄄rLOX
在 pH 值为 7 ~ 8 的范围内比较稳定 ,剩余的相对酶
活均在 75% 以上;当 pH 值低于 7 或大于 8 时 ,剩余
酶活呈显著降低趋势 。 当 pH 值为 9 时, 剩余的相
对酶活降至 18郾 77% ; 当 pH 值为 6 时 , 剩余的相对
酶活降至 6。 说明该酶对 pH 值小于 7 的酸或者 pH
值大于 9 的强碱比较敏感 。 虽然酶的最适反应 pH
值为 9, 但当酶在 pH 值为 9 的缓冲体系中, 其状态
并不稳定 , 酶活降至 18郾 77% ,说明 pH 值为 9 时 ,
ana鄄rLOX 的结构适合酶与底物的反应最大化, 但并
不适合酶的保存 。
图 2摇 ana鄄rLOX pH 值稳定性
Fig. 2摇 Effect of pH on activity stability of ana鄄rLOX
图 3摇 ana鄄rLOX 在不同缓冲体系中酶促反应的 ESR 谱
Fig. 3摇 ESR spectra of ana鄄rLOX treated by different buffer
2郾 2摇 不同缓冲体系中 ana鄄rLOX 产生的自由基
电子自旋共振(ESR) 法是唯一可以直接测定自
由基的方法 ,本实验通过对 ana鄄rLOX 在不同缓冲体
系中酶促反应的监测, 观察酶促反应自由基产生量
的差异 ,为确定 ana鄄rLOX 的最适反应 pH 值提供理
论依据 。 自由基产生量的多少表现在波谱上为信号
强弱, 即峰高; 图 3 显示了 ana鄄rLOX 在不同缓冲体
系中酶促反应的 ESR 谱。 当 ana鄄rLOX 在 pH 值 7、
pH 值 10 的缓冲体系中时,并未检测到明显的自由
基信号 ;采用分光光度法检测酶活时 ,在 pH 值 7 和
pH 值 10 的缓冲体系中是有酶活体现的, 但是酶活
较低。 分析原因,可能是由于其酶促反应产生的自
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