的残基
。
通过研究
,
证明了铁原子中心活性位点包
含有两种类型的配体
:1
个外源配体和
5
个内源配
体
,
内源配体包括
3
种组氨酸残基
( His 499,His
504,His690),1
个
Ile839
残基以及
1
个
Asn694,
外
源配体为水分子
[5 - 7]
。
蛋白质的构象与其生物功能有密切的相关性
,
理论研究表明
,
酶蛋白分子的空间结构即使发生极
其细微的变化
,
也能够极大地影响酶蛋白的生物活
性
,
并且酶蛋白的生物活性功能依赖于结构的运动
性
[8 - 9]
。
酶的二级结构多指肽链有规则的盘旋折叠
所形成的构象
,
主要包括螺旋
、
折叠
、
转角和无序结
构
,
这些结构主要依靠
—NH—,— 詤C O
形成的氢
键使其结构稳定
[10]
。
圆二色
( circular dichroism,
CD)
光谱法是研究稀溶液中蛋白质结构的一种有效
方法
,
它能灵敏地反映出蛋白质构象的变化
。
圆二
色的产生是由光学活性物质对左右圆偏振光的吸光
率的变化引起的
,
一般手性物质的圆二色性与波长
有关
,
对手性物质按照一定的波长扫描即能得到其
CD
光谱图
,
从图谱上可以了解其分子及结构上的手
性特性
。
通过肽键连接而成的蛋白质是具有特定结
构的生物大分子
,
其圆二色性主要由活性生色基团
及折叠结构两方面圆二色性的总和
[11 - 13]
。 CD
光谱
在预测
、
分析蛋白质结构方面发挥着重要作用
。
目
前
,
研究
LOX
酶活与二级结构含量之间相关性的研
究较少
,
关于
pH
值和温度对脂肪氧合酶构象的影
响尚未见报道
。
有研究表明
,
螺旋含量下降
,
折叠含
量增加
,
与酶的钝化有相关性
。
Casey
等
[14]
提出重组脂肪氧合酶将成为食品
加工领域研究中的前沿
。
然而
,
至今为止
,
还未曾
有高效表达脂肪氧合酶的报道
。 Zhang
等
[15]
通过
从鱼腥藻中获得
LOX
基因
,
并在
B. subtilis
中表
达
,
获得了高活性的重组
LOX。
在面团中加入
LOX
后巯基减少
,
增加了谷朊蛋白大分子的含量
和促进了谷朊蛋白间二硫键的形成
,
因而使面团
的筋力提高
。
本研究以重组表达
、
纯化得到的鱼腥藻脂肪
氧合酶
(
Anabaena
Sp. Lipoxygenase,ana鄄rLOX)
为
研究对象
,
通过测定
ana鄄rLOX
在不同缓冲体系
中
,
螺旋
、
折叠
、
转角和无序结构等分子构象的变
化
,
分析
ana鄄rLOX
分子构象变化与不同缓冲体
系之间的关系
,
探求
ana鄄rLOX
构象变化与生物
酶学特性的关系
,
期望从分子构象的变化解释酶
学特性
。
1摇
材料与方法
1. 1摇
实验材料
亚油酸
( LA)
和高纯度
鄄[ 4鄄
吡啶基
鄄1鄄
氧
]鄄N鄄
叔
丁基氮酮
,
均购自西格玛公司
(Sigma Chemical Co. ,
St. Louis, MA, USA);ana鄄rLOX,
本实验室重组
、
发
酵
、
表达和纯化
。
1. 2摇
实验仪器
J鄄810
型圆二色光谱仪
( CD),
日本
Jasco
公司
;
2450
型分光光度计
,
日本
Shimadzu
公司
;EMX
型电
子自旋共振波谱仪
,
德国
Bruker
公司
;LightCycler
誖
480
系统
,
瑞士
Roche
公司
。
1. 3摇
实验方法
1
.
3
.
1摇
ana鄄rLOX
酶活的测定
ana鄄rLOX
活力的测定按
Axelrod
等
[16]
方法进行
,
利用分光光度计测定亚油酸在脂肪氧合酶催化下形成
的共轭二烯产物
,
在
234 nm
波长下吸光值的变化
。 1
个活性单位
(U)
的酶定义为在
25 益
条件下每
1 min
产
生
1 滋mol
的共轭双键所需要的酶量
。
1
.
3
.
2摇
ana鄄rLOX
酶学性质研究
1) ana鄄rLOX
最适反应
pH
值的确定
。
分别用
pH
值为
4,5,6,7,8,9,10(0郾 05 mol / L PBS
缓冲液
以及
Tris鄄HCl
缓冲液
)
的缓冲液将酶液稀释
10
倍
,
加入底物亚油酸
,
在
25 益
条件下
,
测定
ana鄄rLOX
在
不同
pH
值条件下的酶活性
,
重复
3
次
。
2) ana鄄rLOX
的
pH
值稳定性分析
。
将
ana鄄
rLOX
液的
pH
值调至
6,7,8,9,10,4 益
下放置
5 h
后
,
于
pH
值为
9郾 0、25 益
条件下测定
ana鄄rLOX
的酶
活
,
重复
3
次
。
1
.
3
.
3摇
CD
光谱测定
采用圆二色光谱仪测定样品
,
质量浓度为
0郾 15
g / L,
每次进样量为
400 滋L,
室温
25 益,
扫描范围为
190 ~ 250 nm,
分辨率为
0郾 1 nm,
扫描速度为
100
nm / min,
响应度为
0郾 5 s,CD
灵敏度为
0郾 01 伊 10
- 3
,
光谱带宽为
1郾 0 nm,
所有
CD
数据均经过
3
次扫描
,
取平均值
。
1郾 3郾 4摇
ESR
法测定不同缓冲体系中
ana鄄rLOX
产生
的自由基
取
60 滋L
待测样置于电子自旋共振波谱仪
,
ESR
仪谐振腔
,ESR
测定条件中心磁场
,0郾 347 6 T;
微波功率
,5 mW;
微波频率
,9郾 7 GHz;
调制频率
,100
kHz;
调制幅度
,2郾 00 G;
温度
,
室温
;
扫描时间
,60 s。
71
第
33
卷 第
4
期
摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
汪晓鸣等
:
酸碱度对重组鱼腥藻脂肪氧合酶构象与活性的影响
