39 - 食品科学技术学报页

1郾 2摇 培养基及溶液配制
斜面培养基 ( g / L): 麦芽浸粉 140 g, 琼脂粉 20
g,121 益 灭菌 20 min.
种子液培养基 ( g / L): 葡萄糖 60 g, 蛋白胨 20
g,NaNO3 10 g,MgSO 4·7H2 O 5 g,KH2 PO 4 10 g,自来
水 1 000 mL,121 益 灭菌 20 min( 试剂均为分析纯 ) .
固体发酵培养基: 大米, 购于天津农贸市场; 将
大米经自来水浸泡过夜, 分装入 250 mL 三角瓶中,
每瓶 28 g 原料,自来水 12 mL,121 益 灭菌 20 min.
衍生剂: 邻苯二甲醛 (OPA)80 mg,茁鄄巯基乙醇
80 滋L,甲醇 10 mL(OPA 及 茁鄄巯基乙醇为生化试剂,
甲醇为色谱纯) .
硼酸缓冲液: 硼酸 2郾 47 g, 水 100 mL, 用 NaOH
调 pH 值至 10郾 4( 试剂均为分析纯) .
1郾 3摇 主要仪器
8453 型紫外可见分光光度计,美国安捷伦科技
有限公司;1200s 型高效液相色谱仪 ( 配有紫外检测
器、 荧光检测器和 B. 04. 03. SPI87 色谱工作站 ) 美
国安捷伦科技有限公司 ;LRH鄄250鄄G域 型微电脑控
制光照培养箱,广东省医疗器械厂.
1郾 4摇 实验方法
1郾 4郾 1摇 红曲霉菌种活化
用接种环从不同红曲霉菌株的试管斜面上各挑
取一环孢子, 接入 100 mL 种子液培养基中,30 益
180 r / min 培养 36 h 后备用.
1郾 4郾 2 摇 菌种筛选
在无菌条件下, 分别将活化后的菌种培养液进
行无菌过滤, 计数, 将其浓度调整至 2 伊 10 6 个 / mL.
各吸取 5 mL,接入固体发酵培养基中 , 25 益 培养 5
d,分别进行取样, 测定其中 GABA 含量 , 筛选出产
GABA 含量较高的红曲霉菌株.
1郾 4郾 3摇 GABA 测定方法
1郾 4郾 3郾 1 摇 标准曲线绘制
将浓度为 500 滋g / mL 的 GABA 标准水溶液, 稀
释成 10,20,50,100,200 滋g / mL 的标准溶液系列.
以不同 GABA 标准水溶液浓度为横坐标, 以 HPLC
法测定的峰面积数值为纵坐标, 绘图得到 GABA 标
准曲线.
1郾 4郾 3郾 2 摇 样品处理
取不同红曲霉发酵样品,60 益 烘干至恒重 , 粉
碎, 过 100 目筛. 准确称取 0郾 500 0 g 样品, 加入 4
mL 质量分数为 4% 的 TCA 溶液,30 益 水浴 2 h,转
至离心管中,10 000 r / min 离心 10 min, 用 TCA 定容
至 5 mL. 吸取 1 mL 经 0郾 45 滋m 滤膜过滤,经在线衍
生 (2 滋L 样品溶液和 2 滋L 衍生剂)8 min,立即进行
HPLC 检测.
1郾 4郾 3郾 3摇 色谱条件
色谱柱 : Agilent Eclipse AAA ( 150 mm 伊 4郾 6
mm,5 滋m);采用梯度洗脱,流动相 A 为纯净水,1 L,
加 1郾 6译醋酸钠 ( 分析纯 ) 调 pH 值为 7郾 2;流动相 B
为甲醇 颐 乙腈颐 纯净水 = 45 颐 45 颐 10( 体积比 ),1 L, 加
1郾 6译的醋酸钠, 调 pH 值为 7郾 2;0 ~ 2 min 流动相 B
为 20% ,2 ~ 18 min 流动相 B 由 20% 上升至 100% ,
维持 4 min, 在 22 ~ 26 min 内, 流动相 B 由 100% 降
至 20% . 检测器为紫外检测器, 检测波长为 338
nm, 柱温为 25 益,流速为 1 mL / min,进样量为 2 滋L.
1郾 4郾 4摇 桔霉素测定方法
1郾 4郾 4郾 1摇 标准曲线的绘制
将质量浓度为 500 滋g / mL 的桔霉素乙腈标准
溶液分别配制成质量浓度为 0,0郾 05,0郾 10,0郾 50,
1郾 00,2郾 00,5郾 00,10郾 00 g / mL 的标准溶液 . 以不同
浓度的桔霉素标准水溶液浓度为横坐标 , 以 HPLC
法测定的峰面积数值为纵坐标 ,绘图得到桔霉素标
准曲线 .
1郾 4郾 4郾 2 摇 样品处理
取不同红曲霉发酵样品,60 益 烘干至恒重 , 粉
碎 ,过 100 目筛. 准确称取 0郾 500 0 g 样品, 置于 20
mL 离心管中, 加入 8 mL 体积分数 75% 的乙醇 , 超
声波处理 30 min,3 000 r / min 离心 10 min, 重复 3
次 ,合并上清液 ,定容至 25 mL,静置 30 min, 经 0郾 45
滋m 滤膜过滤后用 HPLC 法检测桔霉素含量.
1郾 4郾 4郾 3摇 色谱条件
色谱柱,Agilent TC鄄C18(4郾 6 mm 伊250 mm,5 滋m);
流动相为 V( 乙腈) 颐 V( 甲醇) 颐 V( 水) = 70颐 10颐 20( 用
磷酸调 pH 值为 2郾 66 ~ 2郾 68); 荧光检测器, 检测波
长 姿ex = 331 nm, 姿 em = 500 nm; 柱温 25 益; 流速 1
mL / min; 进样量 20 滋L.
2摇 结果与讨论
2郾 1摇 高产 GABA 的红曲霉菌株的筛选
不同的红曲霉菌株 , GABA 的产量不同, 结果
如图 1.
由图 1 可以看出不同的红曲霉菌株 GABA 产量
多少排序为 :CH鄄1 > CH鄄2 > CH鄄3 > M4 > CS鄄1 >M3 >
CS鄄4 >M1 > CS鄄2 > M7 > M2, 其中红曲霉 CH鄄1 产量为
63 食品科学技术学报 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 2014 年 9 月