食品科学技术学报 - page 47

蔗糖 30 g,干酪素 4 g,琼脂 20 g,自来水 1 000 mL。
3) 产酶培养基:蓖麻饼粕 1 g, 麦芽糖 2 g,NaCl
0郾 9 g,自来水 100 mL。
各培养基灭菌条件均为 121 益,20 min。
1郾 3摇 仪器与设备
HH-B11 型电热恒温培养箱,天津市实验仪器
厂;CHB - 213 型生物显微镜 ,OLYPUS 公司; SP -
2102UV 型紫外可见分光光度计, 上海光谱仪器有
限公司;CL -32L 型全自动智能高压蒸汽灭菌器, 日
本 ALP 公司。
1郾 4摇 实验方法
1郾 4郾 1摇 产蛋白酶菌株的筛选
将蓖麻饼粕稀释液涂布于平板上, 多次分离后
得到单菌落, 将单菌点接于蛋白酶选择性培养基上,
根据透明圈的有无及大小初筛菌株。 将初筛出来的
菌株进行摇瓶发酵复筛,测定发酵液中蛋白酶活力,
选出酶活力最大的菌株作为产蛋白酶菌株 。
1郾 4郾 2摇 蛋白酶活力测定方法
采用 Folin 酚法测蛋白酶活力 [11] ,1 mL 发酵液
加 1 mL 质量分数为 2% 的酪蛋白液,pH 值为 7郾 0,
40 益 水浴 10 min,再加 0郾 4 mol / L 的三氯乙酸 2 mL,
保温 20 min 后离心取 1 mL 上清液 ,加 1 mL Folin 酚
在 5 mL 0郾 4 mol / L 的 NaCO 3 碱性条件下 40 益 水浴
20 min,测 660 nm 下的吸光值,空白实验在加酪蛋白
液之前先加三氯乙酸,使酶失活, 再加酪蛋白液。
蛋白酶活力定义为 1 min 水解酪蛋白产生 1 滋g
酪氨酸所需酶量为一个蛋白酶活力单位 U。
1郾 4郾 3摇 产酶条件优化
将筛选出来的菌株接种到 50 mL 液体产酶培养
基中,32 益,180 r / min 培养 2 d, 测定粗酶液中蛋白
酶活力。 优化碳源、氮源、金属离子、pH 值、接种量、
培养时间对产酶的影响。 在单因素实验的基础上,
采用正交试验优化培养基组分。 试验设麦芽糖
(A)、饼粕(B)、Na + (C)3 个因素, 每个因素设 3 个
水平,因素与水平设计见表 1。 实验设空白列 ,每组
实验做 3 个平行。 进行摇瓶发酵实验 , 确定最佳发
酵产酶培养基成分。
2摇 结果与分析
2郾 1摇 蛋白酶菌株的筛选结果
2郾 1郾 1摇 蛋白酶菌株的初筛结果
将分离自蓖麻饼粕和实验室保存的菌株点接于
酪素平板上 ,以有无透明圈及透明圈大小作为初筛
依据。 结果如表 2。
表 1摇 培养基成分正交试验因素与水平
Tab. 1摇 Orthogonal experiment factors and their levels for
optimization of medium components
水平 A B C
w(麦芽糖) / % w( 饼粕) / % w(NaCl) / %
1 1郾 0 1郾 0 0郾 8
2 2郾 0 2郾 0 0郾 9
3 3郾 0 3郾 0 1郾 0
表 2摇 产蛋白酶菌初筛结果
Tab. 2摇 Primary screening results of protease鄄producing strains
菌种编号 d( 菌落) / mm d( 透明圈) / mm
M 4 5郾 5
B 2郾 5 3郾 5
P3鄄2 1郾 5 5
摇 摇 从表 2 可以看出, 供试菌株虽然能够利用蛋白
质 ,但产生的蛋白酶活力不同, 在菌落周围出现透明
圈大小也不同。 根据透明圈的大小, 可以初步判断
菌株产蛋白酶的能力 。 其中,菌株 M 和菌株 B 是实
验室保存的米曲霉和白地霉,菌株 P3鄄2 是从蓖麻饼
粕中分离出来的细菌。 图 1 是菌株 P3鄄2 在添加酪
素的平板上生长及产生透明圈的情况。
图 1摇 菌株 P3鄄2 在酪素平板上的透明圈
Fig. 1摇 Clearing zones of strain P3鄄2 on casein plates
2郾 1郾 2摇 蛋白酶菌株的复筛结果
将初筛出来的 3 株菌进行发酵产酶复筛, 用福
林试剂法测定中性蛋白酶活力大小, 比较酶活力大
小 ,选出酶活力最大的菌株为目标菌株。 实验结果
如表 3。
从表 3 可以看出, 在相同实验条件下, 菌株 P3鄄2
的蛋白酶活性最高, 后续实验选择其作为产蛋白酶
的菌株 。
44 食品科学技术学报 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 2015 年 1 月