内生菌
(
endophytes
)
是一类可以和植物互利共
生的微生物
,
经研究证明它们可以增加植物的生长
发育和抗逆能力
,
也可通过产生一些代谢产物
,
而提
高植物的药用性能
[14]
。
本文主要研究诺尼叶片中
可培养内生菌的多样性
,
将为诺尼叶片中功能性微
生物的开发利用奠定良好的基础
。
1摇
材料和方法
1郾 1摇
实验材料
实验样品为野生诺尼的新鲜叶片
(
见图
1),
采
集自中国海南省三沙市永兴岛
(
北纬
16郾 83毅,
东经
112郾 34毅),
共计
645 g。
样品存放无菌自封袋中
,4 益
保存
。
图
1摇
野生诺尼叶片样品
Fig. 1摇 Wild Noni leaves samples
1郾 2摇
培养基
玫瑰红钠和
PDA
培养基用于真菌的分离纯化
,
R2A
和
LB
培养基用于细菌的分离纯化
,
均购于北
京陆桥公司
。
1郾 3摇
内生菌的分离培养和保存
采用稀释平板涂布法分离培养诺尼叶片中的内
生菌
。
取不同枝条上的健康叶片
,
称取
10 g
进行表
面灭菌
,
先用无菌水冲洗
2
次
,
滤纸吸干水分后
,
用
体积分数为
75%
的酒精浸泡
30 s,
再用质量分数为
0郾 1%
的氯化汞溶液浸泡
3 min,
最后用无菌水冲洗
3
次
。
用无菌剪刀剪碎叶片
,
于无菌研钵中加入少
量灭菌的石英砂和碳酸钙及少量无菌水充分研磨
,
然后依次用无菌水稀释成质量分数为
1 伊 10
- 1
、1 伊
10
- 2
、1 伊 10
- 3
的组织悬液
。
分别取
100 滋L
悬液涂布于玫瑰红钠平板
(
平板含
有
25 mg / mL
氯霉素和
25 mg / mL
四环素
)
和
R2A
平板
上
,
每个处理
3
个平行
。
玫瑰红钠平板置于
25 益
培养
箱培养
,
从第
2 d
开始对平板上的单菌落进行分离计
数
,
共
7 d,
根据菌落形态
(
包括大小
、
形状
、
颜色
、
质地
、
有无渗透液
,
有无可溶性色素等
),
对可培养真菌进行
初步筛选
,
并利用
PDA
培养基平板纯化菌株
;R2A
平
板置于
28 益
培养箱培养
,
从第一天开始对平板上的细
菌单菌落进行分离计数
,
共
4 d,
根据菌落形态
(
包括大
小
、
形状
、
颜色
、
表面光泽度
、
边缘整齐度
、
透明度和质
地等
)
进行初步筛选
,
利用
LB
培养基平板划线纯化菌
株
。
纯化好的菌株
,
利用试管保藏备份
,
并提交给中国
工业微生物菌种保藏中心
(CICC)
保藏
。
1郾 4摇
内生菌的
DNA
提取与鉴定
1郾 4郾 1摇
内生真菌的
DNA
提取与扩增
采用传统
CTAB
抽提方法
,
提取内生真菌基因
组
DNA,
采用通用引物
: ITS1 (5忆鄄TCC GTA GGT
GAA CCT GCG G鄄3忆)
和
ITS4 (5忆鄄TCC TCC GCT TAT
TGA TAT GC鄄3忆)
扩增
ITS
基因序列
[15]
。 PCR
反应
体系为
:
模板
10 伊 PCR buffer 5 滋L、 dNTP ( 2郾 5
mmol / L) 4 滋L、
模板
2 滋L、Taq DNA
聚合酶
1 滋L、
引
物各
1 滋L,
补充去离子水至
50 滋L。
反应条件
: 94
益 5 min; 94 益 50 s, 55 益 50 s, 72 益 50 s, 33
个循
环
; 72 益 7 min。 PCR
产物用
1%
凝胶电泳进行检
测
,
约为
600 bp。
1郾 4郾 2摇
内生细菌的
DNA
提取与扩增
利用天根公司细菌基因组提取试剂盒
,
提取内
生细菌基因组
DNA,
采 用 通 用 引 物
: 27f ( 5忆鄄
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG鄄3忆)
和
1492r (5忆鄄GGT鄄
TACCT TGTTACGACTT鄄3忆)
扩增
16S rDNA
基因序
列
。 PCR
反应体系同真菌体系
。
反应条件
: 94 益 5
min; 94 益 1 min, 55 益 1 min, 72 益 1郾 3 min, 35
个
循环
; 72 益 10 min。 PCR
产物用
1%
凝胶电泳进行
检测
,
约为
1 500 bp。
所有
PCR
产物都送交上海生工生物工程技术
服务有限公司测序
,
真菌序列与
GenBank
数据库中
已知序列进行
BLAST
比对分析
,
细菌序列与
EzBio鄄
Cloud
数据库比对
,
寻找具有较高同源性的目标序
列
。
确定各菌株的有效序列后用
ClustalX 1郾 83
进
行多序列比对
,
再用
MEGA 5郾 0
进行邻接法
(Neigh鄄
bor鄄Joining)
聚类系统发育分析
[16]
。 1 000
次
( Boot鄄
strap value)
重复自检分析
。
各个种的代表序列均已
提交到
GenBank
核酸序列数据库
,
并得到登录号
KC708557 ~ KC708575。
2摇
结果和分析
2郾 1摇
诺尼叶片中可培养内生菌的分离结果
通过分离纯化共得到诺尼叶片内生菌
32
株
,
利
用测序分析和形态学观察方法
,
将其分为
19
种
。
其
33
第
33
卷 第
1
期
摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
白飞荣等
:
西沙野生诺尼叶片内生菌的分离与初步鉴定
