用仪器有限责任公司
;DL -4C
型低速大容量离心
机
,
上海安亭科学仪器厂
;HH-2
型恒温水浴锅
,
北
京科伟永兴仪器有限公司
;RE -52
型旋转蒸发仪
,
上海安亭实验仪器有限公司
;BS224S
型分析天平
,
北京赛多利斯科学仪器有限公司
。
葡萄糖
、
半乳糖
、
甘露糖标准品
,
纯度为
99% ,
购自美国
Sigma
公司
;
无水乙醇
、95%
乙醇
、
丙酮
、
浓
硫酸
、
苯酚等
,
分析纯
,
国产试剂
;
蒸馏水
,
陕西师范
大学自制
。
1郾 2摇
方法
1郾 2郾 1摇
样品采集与处理
1郾 2郾 1郾 1摇
花椒叶的前处理
花椒叶
2014
年
5 ~ 8
月份采自陕西省渭南市
。
花椒叶经挑选
(
除去茎
、
叶柄和杂物
)
后清洗
、
晾干
,
然后粉碎
、
过筛
(80 ~ 100
目
)、
烘干
(50 ~ 60 益),
置
密闭容器中避光保存
。
1郾 2郾 1郾 2摇
花椒叶多糖的提取
准确称取
10 g
花椒叶粉末
,
置
250 mL
锥形瓶
中
,
加入
200 mL
蒸馏水
,
浸泡过夜
,
然后置
80 益
水
浴中提取
4 h,
抽滤并收集滤液
,
滤渣重复浸提
2
次
,
合并滤液
。
将所得滤液蒸发浓缩后加入
4
倍量体积分
数为
95%
的乙醇
,
室温下沉淀过夜
,
在
4 000 r / min
下离
心
10 min
得到沉淀
。
将沉淀移至
10 mL
离心管中
,
依次用体积分数为
80%
的乙醇
、95%
的乙醇
、
无水
乙醇和丙酮进行漂洗
,
然后挥干溶剂
,
在
30 ~ 40 益
烘干至恒重
,
碾成粉末即得花椒叶多糖样品
。
比色
测定时将多糖样品配制成
籽
为
0郾 05 mg / mL
的水溶
液
(
多糖溶液
)。
1郾 2郾 2摇
方法建立与优化
1郾 2郾 2郾 1摇
标准单糖和工作波长的确定
按照质量分数为
5%
苯酚
0郾 3 mL、
多糖溶液
1郾 0 mL、
浓硫酸
2郾 0 mL
的比例加样
,
混匀后在室温
下显色
20 min,
在
250 ~ 600 nm
波长范围内进行扫
描
;
分别用葡萄糖
、
半乳糖
、
甘露糖
3
种单糖溶液替
代多糖溶液
,
显色后进行扫描
。
通过比较单糖
、
多糖
的吸收光谱确定标准单糖和工作波长
。
1郾 2郾 2郾 2摇
加样次序的确定
测定不同样品添加顺序
(
样品
-
苯酚
-
浓硫酸
、
样品
-
浓硫酸
-
苯酚
、
浓硫酸
-
样品
-
苯酚
、
浓硫酸
-
苯
酚
-
样品
、
苯酚
-
样品
-
浓硫酸
、
苯酚
-
浓硫酸
-
样品
)
对吸光度的影响
,
以确定较佳加样次序
。
加样量为
质量分数
5%
苯酚
0郾 3 mL、
多糖溶液
1郾 0 mL、
浓硫酸
2郾 0 mL。
显色温度为室温
,
显色时间
20 min。
1郾 2郾 2郾 3摇
显色时间对吸光度的影响
按照质量分数为
5%
苯酚
0郾 3 mL、
多糖溶液
1郾 0 mL、
浓硫酸
2郾 0 mL
的比例依次加样
,
混匀后在
室温下分别显色
5,10,20,25,30 min,
测定吸光度
。
1郾 2郾 2郾 4摇
浓硫酸添加量对吸光度的影响
按照质量分数为
5%
苯酚为
0郾 3 mL,
多糖溶液
为
1郾 0 mL,
浓硫酸分别为
1郾 0,1郾 5,2郾 0,2郾 5,3郾 0,
3郾 5,4郾 0 mL
的比例依次加样
。
混匀后在室温下显
色
25 min,
测定吸光度
。
1郾 2郾 2郾 5摇
苯酚添加量对吸光度的影响
在质量分数为
5%
的苯酚分别为
0郾 1,0郾 2,0郾 3,
0郾 4,0郾 5 mL
的条件下
,
依次加入多糖溶液
1郾 0 mL、
浓硫酸
3郾 5 mL,
室温下显色
2 5min,
测定吸光度
。
1郾 2郾 2郾 6摇
显色温度对吸光度的影响
按照质量分数为
5%
苯酚
0郾 2 mL、
多糖溶液
1郾 0 mL、
浓硫酸
3郾 5 mL
的比例依次加样
,
混匀后分别在
10,20,30,40,50 益
下显色
25 min,
测定吸光度
。
1郾 2郾 2郾 7摇
正交试验设计
根据上述单因素实验结果
,
选择显色时间
、
浓硫
酸添加量
、
质量分数
5%
苯酚添加量
、
显色温度
4
个
变量进行四因素三水平正交试验
,
确定较优组合条
件
。
每组实验设
2
个重复
。
1郾 2郾 3摇
方法考察与评价
1郾 2郾 3郾 1摇
标准曲线的绘制
精确配制
籽
分别为
5郾 00,10郾 00,20郾 00,30郾 00,
40郾 00,50郾 00,60郾 00 滋g / mL
的半乳糖标准溶液
,
按
照质量分数为
5%
苯酚
0郾 3 mL、
半乳糖标准溶液
1郾 0 mL、
浓硫酸
3郾 5 mL
的比例加样
,
混匀后在
25 益
显色
30 min,
在
484 nm
处测定吸光度
。
每个浓度设
5
个重复
。
1郾 2郾 3郾 2摇 LOD
和
LOQ
的测定
参照
Rolim
等
[7]
的方法测定
LOD
和
LOQ。
1郾 2郾 3郾 3摇
精密度实验
参照
Shabir
[8]
的方法连续
3
天重复测定高
、
低
两种浓度花椒叶多糖溶液中多糖的含量
,
计算日内
精密度
(
n
= 5)
和日间精密度
(
n
= 15)。
1郾 2郾 3郾 4摇
回收率实验
参照
Rolim
等
[7]
的方法将一定量的高
、
低两个
浓度水平的半乳糖标准溶液
(
籽
分别为
30郾 00、50郾 00
滋g / mL)
与已知浓度花椒叶多糖溶液混合
,
显色后测
定吸光度和总糖含量
,
计算加标回收率
。
1郾 2郾 3郾 5摇
稳定性实验
取一定量的花椒叶多糖溶液
,
在最佳显色反应
14
第
33
卷 第
4
期
摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
齐素芬等
:
苯酚
-
硫酸法测定花椒叶多糖含量
