益
电泳
15 h,
电泳结束后溴化乙锭染色
20 min,
然后
用水漂洗
20 min,
通过凝胶成像系统成像
。 PCR
扩
增条带切胶回收纯化
,
送北京华大基因
TA
克隆测
序
。
将测序得到的
16S rDNA
序列在
Genebank
上进
行序列比对
,
得到每条条带菌所属的类别
,
并比较不
同泳道
(
组别
)
样本中不同门类菌的相对含量
。
1郾 3郾 4摇
质粒标准品制备
采用特异性引物进行
PCR,
纯化
PCR
产物
,
测
定其浓度
,
并根据其分子量计算其拷贝数
,
即得相应
菌属的质粒标准品
。
各菌属扩增引物及条件为
:
乳酸菌属特异性扩增
[8]
。
引物
Lac1:5爷鄄AG鄄
CAGTAGGGAATCTTCCA鄄3 爷。 Lac2: 5 爷鄄ATTYCAC鄄
CGCTACACATG鄄3爷。
扩增体系同
1郾 3郾 3
中
25 滋L
体
系
。
反应条件
:94 益
预变性
2 min;94 益
变性
30 s,61
益
退火
1 min,72 益
延伸
1 min,
进行
30
个循环
;72
益
延伸
7 min。
拟杆菌特异性扩增
[9]
。
引物
Bfr鄄F: 5 爷鄄CT鄄
GAACCAGCCAAGTAGCG鄄3 爷。 Bfr鄄R: 5 爷鄄CCGCAA鄄
ACTTTCACAACTGACTTA鄄3爷。
扩增体系同
1郾 3郾 3
中
25 滋L
体系
。
反应条件
:95 益
预变性
2 min;95 益
变
性
30 s,52 益
退火
30 s,72 益
延伸
1 min,
进行
30
个
循环
;72 益
延伸
5 min。
柔嫩梭菌特异性扩增
[10 - 11]
。
引物
Clep鄄F:5爷鄄
GCACAAGCAGTGGAGT鄄3 爷。 Clep鄄R3: 5 爷鄄CTTC鄄
CTCCGTTTTGTCAA鄄3爷。
扩增体系同
1郾 3郾 3
中
25 滋L
体系
。
反应条件
:94 益
预变性
5 min;94 益
变性
20 s,
50 益
退火
20 s,72 益
延伸
30 s,
进行
30
个循环
;72 益
延伸
5 min。
1郾 3郾 5摇
特定菌属的
RT鄄PCR
检测
质粒标准品进行
10
倍梯度稀释
,
获得系列拷贝
数梯度的质粒标准品
,
以此为模板进行
RT鄄PCR。
以
PCR
反应的
C
t
值为纵坐标
,
初始拷贝数的对数
作为横坐标
,
构建标准曲线
。
不同菌属的实时荧光定量
PCR(25 滋L)
的扩增
体系
:12郾 5 滋L
染料
SYBR Green 域,
上下游引物各
1
滋L,DNA
模板或者质粒标准品
1 滋L,
双蒸水
9郾 5
滋L。
乳酸菌实时荧光定量
PCR
反应程序
:94 益
预
变性
3 min;94 益
变性
10 s,56 益
退火
30 s,72 益
延伸
30 s,
进行
40
个循环
;55 益
保持
10 s
后
,
读取反应管
中的荧光信号
。
拟杆菌实时荧光定量
PCR
反应程
序
:94 益
预变性
3 min;94 益
变性
10 s,60 益
退火
30
s,72 益
延伸
30 s,
进行
40
个循环
;55 益
保持
10 s
后
,
读取反应管中的荧光信号
。
柔嫩梭菌实时荧光定量
PCR
反应程序
:94 益
预变性
3 min;94 益
变性
10 s,
54 益
退火
30 s,72 益
延伸
30 s,
进行
40
个循环
;55 益
保持
10 s
后
,
读取反应管中的荧光信号
。
每个样本
重复
3
次
,
根据标准曲线计算样本中该菌初始拷贝
数
,
换算成每克粪便样本中该菌的初始拷贝数
。
1郾 3郾 6摇
数据处理
应用
Quantity One
软件对
DGGE
图谱进行数字
化处理
;
采用
SIMCA 13郾 0
统计软件进行多元统计
分析
PCA, PLS鄄DA
分析
;
采用
SPSS 17郾 0
软件进行
显著性检验
;
采用
Origin 8郾 5
软件绘图
。
2摇
结果与分析
2郾 1摇
大鼠体重变化情况
造模成功后
,
按实验设计给药处理
6
周
,
每周测
量各组大鼠体重
,
体重动态变化如图
1。
*
与模型组相比有显著变化
(
P
< 0郾 05)
图
1摇
营养肥胖模型大鼠灌胃原花青素期间体重变化
Fig. 1摇 Change of body weight of diet鄄induced obesity
rats treated with grape seed procyanidins
从图
1
可以看出
,
灌胃初期
,
灌胃组和模型组体
重几乎没有差异
,
均高于正常组体重
20% 。
随着灌
胃时间的延长
,
高
、
中
、
低剂量原花青素灌胃组体重
相较于模型组体重均有所减轻
。
第
5
周低剂量组体
重显著低于模型组
(
P
< 0郾 05),
第
6
周中
、
低剂量组
体重均显著低于模型组
(
P
< 0郾 05)。
高剂量组和阳
性组体重有降低趋势
,
但不显著
。
2郾 2摇 DGGE
分析
将检测合格的各组大鼠粪便
DNA
样品
,
进行
DGGE
分析
,
染色后凝胶成像得到
DGGE
图谱如
图
2。
从图
2
中可以看出
,
不同组别的
DGGE
图谱存
在相似和不同的条带
,
但直观上难以看出区别
。
故
采用
Quantity one
软件数字化处理
,
每个条带的光密
14
第
33
卷 第
5
期
摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
宋雪琳等
:
葡萄籽原花青素对营养肥胖模型大鼠肠道菌群的影响
