Page 116 - 《食品科学技术学报》2020年第5期
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第 38 卷 第 5 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 余奕宏等: 茁鄄葡萄糖苷酶生物转化刺梨槲皮素糖苷的工艺优化                                      1 1 1


   值(4郾 0、4郾 5、5郾 0、 5郾 5、 6郾 0、 6郾 5、 7郾 0 )、 酶 解 温 度  Origin 8郾 0 软件制图。
   (30、35、40、45、50、55、60 益)、酶用量(酶与底物质
                                                                 表 1摇 响应面试验因素与水平
   量 比 ) ( 0郾 030% 、 0郾 040% 、 0郾 050% 、 0郾 075% 、
                                                          Tab. 1摇 Factors and levels of response surface test
   0郾 100% 、0郾 200% )对糖苷转化率的影响,反应完成
                                                                                   水平
   后冰浴3 min 终止反应,加入等体积甲醇,样品经                                因素
                                                                          - 1       0        1
   0郾 45 滋m 滤膜过滤,取 10 滋L 进行 HPLC 检测        [12,15]  。
                                                        X 1 酶解时间/ min     20       30        40
   1郾 3郾 8摇 响应面优化试验
                                                        X 2 酶解 pH 值      4郾 5      5郾 0      5郾 5
       在最优来源的杏仁 茁鄄葡萄糖苷酶水解条件单
                                                        X 3 酶解温度/ 益       45       50        55
   因素实验结果基础上,进行 Box鄄Behnken 试验,以槲
                                                        X 4 酶用量/ %       0郾 05     0郾 08    0郾 10
   皮素鄄3鄄O鄄芸香糖苷转化率(Y )、槲皮素鄄3鄄O鄄鼠李糖
                             1
   苷转化率(Y )、槲皮素鄄3鄄O鄄葡萄糖苷转化率(Y )为
              2                              3       2摇 结果与分析
   评价指标,进行四因素三水平 Box鄄Behnken 试验,因
   素与水平见表 1。                                         2郾 1摇 标准曲线的建立
   1郾 4摇 数据处理                                            回归方程与线性范围见表 2,考察结果证明 3
       每组实验重复 3 次,采用 SPSS 22郾 0 软件进行                 种糖苷在 0郾 01 ~ 0郾 20 mg / mL 线性良好,槲皮素在
   显著性分析,Design鄄Expert 8郾 0郾 6 软件设计响应面               0郾 004 5 ~ 0郾 144 0 mg / mL 线性良好,可为后续样品
   试验方案, 建立数学模型并进行多元回归分析,                            含量测定提供可靠依据。
   摇 摇 摇 摇                            表 2摇 不同黄酮化合物的回归方程

                                 Tab. 2摇 Regression equation of different flavonoids
            成分                       回归方程                      线性范围/ (mg·mL  - 1  )        R 2
       槲皮素鄄3鄄O鄄芸香糖苷            y = 22 769郾 486 8x - 13郾 309 4     0郾 01 ~ 0郾 20          0郾 999 7
       槲皮素鄄3鄄O鄄葡萄糖苷            y = 16 384郾 524 8x - 20郾 166 5     0郾 01 ~ 0郾 20          0郾 999 9
       槲皮素鄄3鄄O鄄鼠李糖苷            y = 15 842郾 804 5x - 30郾 652 5     0郾 01 ~ 0郾 20          0郾 999 4
           槲皮素                 y = 28 302郾 634 1x - 20郾 018 3   0郾 004 5 ~ 0郾 144 0      0郾 999 8

   2郾 2摇 不同来源 茁鄄葡萄糖苷酶对刺梨槲皮素糖苷的                       处的羟基可以形成额外的氢键,增强酶与底物的
        酶解效果                                         作用   [19]  ,因而 茁鄄葡萄糖苷酶 对 槲 皮 素鄄3鄄O鄄葡 萄
   2郾 2郾 1摇 茁鄄葡萄糖苷酶对槲皮素糖苷转化率的影响                      糖苷水解转化率最高。
       茁鄄葡萄糖苷酶通过断裂槲皮素糖苷化合物之间                         2郾 2郾 2摇 茁鄄葡萄糖苷酶对槲皮素含量的影响
   的糖苷键来完成对底物的水解,不同来源的 茁鄄葡萄                              不同来源 茁鄄葡萄糖苷酶对槲皮素含量的影响

   糖苷酶结构与组成不同,糖基化程度、糖链聚合度、                           见图 2。 由于 茁鄄葡萄糖苷酶的种类众多,其苷元结
   糖链分支与相对分子质量差异较大,一级结构、活性                           合位点处的氨基酸残基呈现多样性,活性位点外的
   区域氨基酸序列中心基团以及具催化作用的氨基酸                            部分氨基酸也能通过非共价作用影响活性中心的氨
   残基排列及状态不同          [16] ,从而导致它们对不同底物              基酸对底物的专一性          [20] 。 此外,茁鄄葡萄糖苷酶催化
   亲和力及水解机制存在差异。 3 种来源的 茁鄄葡萄糖                        活性中心结构以及氨基酸活性位点位置不同导致表
   苷酶对槲皮素糖苷转化率的影响见图 1。 由图 1 可                        面电势差异,因此,茁鄄葡萄糖苷酶与构成苷元结合位
   以看出,反应 60 min 时,3 种 茁鄄葡萄糖苷酶对槲皮                    点的氨基酸残基及与活性中心以外的氨基酸残基的
   素鄄3鄄O鄄葡萄 糖 苷 的 转 化 率 均 为 最 高, 分 别 为               作用机制存在差异         [21] ,使不同 茁鄄葡萄糖苷酶具有不
   74郾 10% 、70郾 50% 、62郾 50% 。 茁鄄葡萄糖苷酶水解槲            同的底物结合及催化作用模式。 由图 2 可以直观地
   皮素糖苷键的能力取决于糖基                 [17] ,槲 皮 素 苷 元     看出各来源的 茁鄄葡萄糖苷酶对槲皮素糖苷的整体
   的糖基不同对酶的水解效率影 响 显 著                  [18]  ,且 双   转化程度。 由杏仁 茁鄄葡萄糖苷酶转化所得槲皮素
   糖苷的转换速率比单糖苷慢。 槲皮素鄄3鄄O鄄葡萄                          含量一直最高,反应 30 min 时含量达到 152郾 60 滋g /
   糖苷只有一个葡萄糖基,在葡萄糖基的特定位点                             mL。 水解作用较优的杏仁 茁鄄葡萄糖苷酶对不同底
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