Page 115 - 《食品科学技术学报》2020年第5期
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1 1 0                                   食品科学技术学报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇     摇 2020 年 9 月


   杆菌 3 种来源的 茁鄄葡萄糖苷酶酶解刺梨槲皮素鄄3鄄                       1郾 3郾 3摇 菌种活化培养基配制
   O鄄芸香糖苷(Rut)、槲皮素鄄3鄄O鄄鼠李糖苷( Que) 和                      MRS 培养基:参照丁小娟等           [13]  配制方法。
   槲皮素鄄3鄄O鄄葡萄糖苷(Iso) 的黄酮苷元特性及酶解                          菌种活化:MRS 活化培养液 121 益,0郾 1 MPa 灭
   条件,筛选较优 茁鄄葡萄糖苷酶,探讨提高刺梨黄酮                          菌 30 min,接入嗜酸乳杆菌 GIM郾 1郾 208,37 益静置培
   苷元释放能力的生物转化途径,以期为刺梨黄酮的                            养 24 h 备用。
   研究开发提供理论基础,为药物和功能食品提供丰                            1郾 3郾 4摇 标准溶液的配制

   富的资源。                                                 称取槲皮素 4郾 5 mg,槲皮素鄄3鄄O鄄芸香糖苷、槲
                                                     皮素鄄3鄄O鄄葡萄糖苷、槲皮素鄄3鄄O鄄鼠李糖苷标准品各
   1摇 材料与方法                                          5郾 0 mg 加甲醇溶解,于 25 mL 容量瓶中定容,得到质
                                                     量浓度分别为 0郾 18、0郾 20、0郾 20、0郾 20 mg / mL 标准品
   1郾 1摇 材料与试剂
                                                     储备液,分别吸取 0、1郾 0、2郾 0、4郾 0、8郾 0、16郾 0 mL 定
       刺梨:贵农 5 号种植品种,摘于贵州省龙里县,
                                                     容至 20 mL 容量瓶中,进行 HPLC 分析。 以 HPLC
   新鲜洁净, 大小均匀无霉烂, 密封装袋后冻藏于
                                                     测得的峰面积为 y 轴,标准品质量浓度为 x 轴,绘制
    - 20 益的冰箱备用。
                                                     标准曲线。
       试剂:槲皮素标准品、槲皮素鄄3鄄O鄄鼠李糖苷标
                                                     1郾 3郾 5摇 样品溶液的制备
   准品、槲皮素鄄3鄄O鄄葡萄糖苷标准品、槲皮素鄄3鄄O鄄芸
                                                         将刺梨真空冷冻干燥后粉碎,得刺梨干粉备用。
   香糖苷标准品,纯度均大于等于 98郾 0% ,上海源叶
                                                     称取适量刺梨粉于锥形瓶中按液料比 20颐 1 (mL/ g)
   生物科技有限公司;对硝基苯酚,南京大唐化工有限责
                                                     加入体积分数 70% 乙醇,300 W、50 益 条件下超声
   任公司;对硝基苯酚鄄茁鄄D 葡萄糖苷(p鄄NPG)、杏仁 茁鄄葡
                                                     40 min,石油醚去除脂溶性色素,4 000 r/ min 离心
   萄糖苷酶,美国 Sigma 公司;嗜酸乳杆菌 GIM郾 1郾 208,贵
                                                     5 ~ 10 min, 收 集 上 清 液 浓 缩, 加 入 预 处 理 好 的
   州轻化工中心;木霉 茁鄄葡萄糖苷酶(Trichoderma 茁鄄glu鄄
                                                     HPD600 树脂层析柱上进行纯化富集,吸附饱和后,
   cosidase),江苏锐阳生物科技有限公司;无水乙醇、磷
                                                     用体积分数 70% 乙醇洗脱,收集洗脱液,制得纯化
   酸,均为分析纯,济南明星化工有限公司;甲醇、乙腈,
                                                     样品溶液,灭活内源酶备用。
   均为色谱纯,美国 Tedia 公司;其他试剂均为分析纯。
                                                     1郾 3郾 6摇 不同来源 茁鄄葡萄糖苷酶对槲皮素糖苷转化
   1郾 2摇 仪器与设备
                                                             率的测定
       1260 型高效液相色谱仪(配有 DAD 检测器/ 紫                       参照文献[12] 适当修改。 以不加任何酶的体
   外-荧光检测器),美国 Agilent 公司;SpectraMAX190              系为空白组,其他实验组分别加入 1 U/ mL 的 3 种
   型光吸收酶标仪 ,美谷分子仪器(上海) 有限公司;                         茁鄄葡萄糖苷酶      [14]  。 反应体系 200 滋L,包含样品液 20
   TGL20M 型台式高速冷冻离心机,诸城鼎力机械有
                                                     滋L、磷酸钠缓冲溶液(pH 值 5,50 mmol/ L)120 滋L、
   限公司。                                              酶液 60 滋L。 在 50 益,pH 值 5 的条件下分别反应
   1郾 3摇 实验方法                                        10、20、30、40、50、60 min,反应完成后冰浴3 min 终
   1郾 3郾 1摇 液相色谱条件                                   止反应,加入等体积甲醇,样品经 0郾 45 滋m 滤膜过
       参考文献[12],色谱柱为 ACI C (250 mm 伊
                                     18              滤,取 10 滋L 进行 HPLC 检测,根据式(1),计算各 茁鄄
   4郾 6 mm),流动相为乙腈 - 0郾 4% 磷酸水溶液(体积                  葡萄糖苷酶酶解槲皮素糖苷的转化率。
   比 28颐 72),流速 1郾 0 mL/ min,柱温 25 益,检测波长                                籽 - 籽
                                                                 转化率 =       0  伊 100% 摇 。      (1)
   360 nm,进样量 10 滋L。                                                       籽
   1郾 3郾 2摇 酶比活力的测定                                      式(1)中:籽 为酶解前槲皮素糖苷质量浓度,滋g /
       酶比活力的测定采用丁小娟等               [13] 的方法,即以       mL,籽 为酶解后剩余糖苷质量浓度,滋g / mL。
                                                          0
   p鄄NPG 为底物,在 茁鄄葡萄糖苷酶作用下水解成 p鄄NP                    1郾 3郾 7摇 杏仁 茁鄄葡萄糖苷酶水解槲皮素糖苷单因素
   (对硝基苯酚) 和葡萄糖,利用 p鄄NP 在碱性条件下                               实验
   显色的原理,测定 茁鄄葡萄糖苷酶的酶活力。 1 mL 酶                          反应体系 200 滋L:样品液 20 滋L、磷酸钠缓冲溶
   液 1 min 酶解1 滋mol p鄄NPG 产生 1 滋mol p鄄NP 所需          液(pH 值 5,50 mmol/ L)120 滋L、酶液 60 滋L。 分别
   的酶量,定义为一个酶活力单位,以 U/ mL 表示。                        考察酶解时间(10、20、30、40、50、60 min)、酶解 pH
   110   111   112   113   114   115   116   117   118   119   120