Page 38 - 《食品科学技术学报》2026年第1期
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ሕ ࿗ 食品科学技术学报জজজজজজজজজজজজজজজজ জ ԡᤃ 年 ϟ 月
双光束紫外可见分光光度计ᖔ北京普析通用仪器有 加入冰预冷的 ϟቝᆍ ᣰ ᓂ 山梨醇溶液ྉϟ ቝᓂɯ ᖔ即得重
限责任公司ᤥ 组菌 株ᤥ 收集重组菌株ᖔ 涂布在 ᥘ᧕ 平板上ᤥ
ϓᤫ ᇺই 实验方法 ሕԡ ቩ 培养 ሕጲ ጢ ʛ 后ᖔ收集所有 菌 株ᖔ均匀涂布在
ϓᤫ ᇺᤫ ϓই 柠檬酸杆菌黑芥子酶 ऊቝᢃʢ 的序列分析 含有不同 质 量 浓 度 ྉ ϟԡԡܦሕԡԡܦጢԡԡܦϟ ԡԡԡ ဂ੫ ᣰ ቝᓂɯ
利 用在线软件 ጶ۪ዶ୩ᢃ ۪ʢᆍᡷ۪ᑕʢᑕቝ ྉ ၤᡷᡷᡱ᧥ ᣰ ᣰ 遗传 霉 素 的 ɟ۪᧕ 固体培养基上ᖔሕԡ ቩ 培养 ሕጲ
औᔀᤦ᥊ ᔀᡱᑕ༁ᢃ᥊ ᆍʢ੫ ᣰ ᡱʢᆍᡷᡱᑕʢᑕቝ ᣰ ɯ 分析基因编码的氨基 ጢʛᖔ直至长出菌落ᤥ
酸ܦ蛋白质的分子质量及等电点等ଫ使用在线软件 筛选获 得 的 重 组 毕 赤酵母工程菌株ᖔ 接种至
ዶᡱၤᑕ èᆍʛሕ ྉ ၤᡷᡷᡱ༁᧥ ᣰ ᣰ ᑕᡱၤᑕᆍʛ༁ᔀʢᔀʢ᥊ ዹᆍቝ ᣰ ɯ 对蛋白 ାᥘ᥈ɟ 培养基中ᖔሕԡ ቩ 振荡培养 ࿗ऐ ၤᖔ按照体积分数
质进行三级结构预测ଫ使用 ऊࣼ༁ᡷᑕᣮ ϟ᥊ ऐሕ 软件进行 ጢᠮ 的接种量转接至 ାᥘᥘɟ 培养基中ᤥሕԡ ቩ 继续诱
多 序 列比对分析ᖔ 并利用在线软件 ྉၤᡷᡷᡱ༁᧥ ᣰ ᣰ 导培养 ጢʛᖔ每 ࿗ ၤ 补加甲醇 ϟ 次ᖔ使其终体积分数
ᔀ༁ᡱʢᔽᡱᡷ᥊ ᔽᤦዹᡱ᥊ ʢ ᣰ ጶ୩۪ʢᔽᡱᡷ ᣰ ዹ੫ᔽ᥋ᤦᔽႿ ᣰ ጶ୩۪ʢᔽᡱᡷ᥊ ዹ੫ᔽɯ 制作序 为 ԡ᥊ ጢᠮ ᤥ 分别在每次加甲醇之前取样ᖔ测定培养
列比对图ᤥ 上清液的黑芥子酶活性ᤥ
ϓᤫ ᇺᤫ ԣই 柠檬酸杆菌黑芥子酶基因克隆和表达 ϓᤫ ᇺᤫ ᇺই 毕赤酵母高密度发酵产 ऊቝᢃʢ 与纯化
以黑芥子酶 ࣷቂᡥʗྉ ᥈ᔀႿᔀାᑕႿҴ᧥ ዶᓂᥘጢऐ࿗ᤃᤃ᥊ ϟɯ 为 选择摇 瓶 发 酵 产 酶 水平最高的菌株ᖔ 接种至
目的基因ᖔ通过 ୩ᔽ੫Ⴟᑕ۪ ࿗᥊ ϟ 预测其相应的信号肽序 ϟጢԡ ቝᓂ ɟ۪᧕ 培养基中ᖔሕԡ ቩ 和 ԡԡ ʢ ᣰ ቝᔽႿ 条件下培
列ᤥ 使用 软 件 ᧕શዶᥘጶશ 确定其限制性酶切位点 养至 ᧣ᦵ 为 ϟԡ᥊ ԡ 左右ᤥ 基础培养᧥将种子液按照
ᤃԡԡ
Ⴅᐹା᧧ 和 ટᅳᡙ ᧧ଫ使用软件 ۪ʢᔽቝᔀʢ ۪ʢᔀቝᔽᔀʢ ጢ᥊ ԡ 设计引 体积分数为 ϟԡᠮ 的接种量接种到 ጢᓂ 发酵罐中ྉ 装
物ᤥ 以 ࣷᔠᡙʗᅳᤇᐹዞᡙᓣʗ ༁ᡱ᥊ 基因组 ᧕શዶ ྉ 细菌基因组 有 ϟ᥊ ጢ ᓂ ା୩ᥘ 培养基ɯᖔ采用体积分数为 ऐᠮ 的浓氨
ͱሕ
᧕શዶ 提取试剂盒提取ɯ为模板ᖔ利用上游引物 ࣷቂᡥʗ᥋ 水调节溶液 ᡱ̀ 值为 ጢ᥊ ԡᖔ加入体积分数为 ࿗᥊ ሕጢ ġ ϟԡ
è᧥ ዶ᥈ዶዶዶዶ᥈ዶ᥈ዶ᥈᥈ऊఋ᥈ዶዶ᥈ऊఋఋዶऊ᥈ఋዶዶ᥈ఋዶఋఋ 的痕盐溶液 ྉ ۪ఋᥘϟɯᖔ转速 ᤃԡԡ ʢ ᣰ ቝᔽႿᖔ 温度 ሕԡ ቩ ᤥ
ऊዶ᥈ዶ᥈ఋ᥈ऊఋऊዶ᥈ऊዶዶऊऊऊ 和 下 游引物 ࣷቂᡥʗ᥋᧥ 甘油流加᧥待 ା୩ᥘ 培养基中的甘油消耗完全ᖔ采用
ఋ᥈ఋऊఋዶዶ᥈᥈ऊ᥈ዶዶఋఋዶዶఋఋऊ᥈ऊ᥈᥈ऊऊ᥈ऊఋऊዶ᥈ऊ᥈ఋ᥈ 间歇式流加方式补料ᖔ补料培养基为质量分数为
ఋऊዶ᥈ఋऊऊ᥈ዶዶఋऊऊ 扩增去除信号肽 ྉϟ᥋࿗ ᑕᑕɯ 的黑 ጢԡᠮ 的甘油ᤥ 控制发酵液的温度为 ሕԡ ቩ 和 ᡱ̀ 值
芥子酶基因 ࣷቂᡥʗᤥ۪ऊ 反应体系 ྉጢԡ ဂᓂɯ᧥ϟԡ ġ 为 ጢ᥊ ԡᖔ全程监控溶氧ྉ᧕ᨃɯ 并保持发酵罐中的溶氧
ఋʢᑕႿ༁୩ᡷᑕʢᡷ èᑕ༁ᡷ ۪ࣼ ାࣼᔀʢ ጢ ဂᓂᖔʛશఋ۪༁ྉ᥊ ጢ ቝቝᆍ ᣰ ᓂɯ 值大于 ϟጢᠮ ᖔ流加时间为 ऐጲ ϟԡ ၤᤥ 待菌体湿重达到
࿗ဂᓂᖔࣷቂᡥʗ᥋è 和 ࣷቂᡥʗ᥋ 各 ϟဂᓂᖔ模板 ᧕શዶ ϟ ဂᓂᖔ ԡԡጲ ጢԡ੫ ᣰ ᓂᖔ停止流加甘油ᖔ并维持 ሕၤ 左右ᤥ 甲醇
èᑕ༁ᡷ ۪ࣼ ᧕શዶ 聚合酶 ϟဂᓂᖔ补足蒸馏水至 ጢԡ ဂᓂᤥ 诱导᧥流加 ϟԡԡᠮ 甲醇诱导ᖔ转速调节至 ऐԡԡ ʢ ᣰ ቝᔽႿᖔ监
۪ऊ 扩增条件᧥ँጢቩ ሕቝᔽႿᖔँጢቩ ሕԡ ༁ᖔጢጢ ቩ ሕԡ ༁ᖔ 控溶氧大于 ϟጢᠮ ᖔ控制温度为 ሕԡ ቩ 和 ᡱ̀ 值为 ᤃ᥊ ԡᖔ
Ꭾ ቩ ϟ ቝᔽႿᖔሕ࿗ 个循环ᖔᎮ ቩ ϟԡ ቝᔽႿᤥ ۪ऊ 产物胶 直至发酵结束ᤥ 发酵过程中取样测定菌体湿重ܦ蛋
回收后ᖔ通过无缝克隆连接至 ᡱ۪᧧ऊँ 质粒ᖔ构建 白含量和酶活力ᤥ
重组质粒 ᡱ۪᧧ऊँ᥋ࣷቂᡥʗᖔ并转化至大肠杆菌 ᧕̀ጢም 将高密度发酵获得的发酵液离心ྉϟԡ ԡԡԡ ʢ ᣰ ቝᔽႿᖔ
菌株中ᖔ筛选阳性转化 子并验证ᤥᡱ۪᧧ऊँ 质粒中 ጢቝᔽႿᖔ࿗ ቩ ɯᖔ 收 集上清液ᤥ 取 ጢԡ ቝᓂ 上清液置于
含有醇氧化酶 ዛ᧣ᣏϟ 启动子ᖔ是甲醇诱导的强启动 ఋʢᔽ༁᥋̀ऊ 缓冲液ྉԡ ቝቝᆍ ᣰ ᓂᖔᡱ̀ 值为 Ꭾ᥊ ԡɯ中透析过
子ᖔ在 ᣞ᥊ ᡓ၊ᐹஏஏᔠᔠ 表达系统生产重组蛋白中得到 广 夜ᖔ透析结束后离心 ྉϟԡ ԡԡԡ ʢ ᣰ ቝᔽႿᖔጢ ቝᔽႿɯᖔ获得粗
泛应用 Џϟँ ᤥ 酶液ᤥ 用缓冲液 ዶྉ ఋʢᔽ༁᥋̀ऊᖔԡ ቝቝᆍ ᣰ ᓂᖔ ᡱ̀ 值为
阳性转化子接种于 ᓂା 液体培养基中ᖔሕᎮ ቩ 和 Ꭾ᥊ ԡɯ平衡 ͐᥋୩ᔀᡱၤᑕʢᆍ༁ᔀ 阴离子交换层析柱 ጢጲ ϟԡ 个
ԡ ʢ ᣰ ቝᔽႿ 条件下振荡培养过夜ᤥ 利用质粒提 取 试 柱体积ᖔ收集的酶液以 ԡ᥊ ጢ ቝᓂ ᣰ ቝᔽႿ 流速上样ᖔ用缓
剂盒提取重组质粒 ᡱ۪᧧ऊँ᥋ࣷቂᡥʗᤥ ᐹᤀ ᧧ 线性化重 冲液 ዶ 与缓冲液 ାྉԡ ቝቝᆍ ᣰ ᓂ ఋʢᔽ༁᥋̀ऊᖔጢԡԡ ቝቝᆍ ᣰ ᓂ
组质粒ᖔ并醇沉回收ᤥ 毕赤酵母ྉऐԡ ဂᓂɯ 感受态细 શᑕऊᖔ ᡱ̀ 值为 Ꭾ᥊ ԡɯ线性洗脱至 ᧣ᦵ ጐԡ᥊ ϟᖔ收集具
ऐԡ
胞与线性化的 ᡱ۪᧧ऊँ᥋ࣷቂᡥʗྉ 约 ϟԡ ဂ੫ɯ 充分混合 有黑芥子酶活力的组分ᖔ透析得到纯化后表达产物ᖔ
后ᖔ转移至电转杯ྉԡ᥊ ዹቝɯ 中冰浴 ጢቝᔽႿᤥ 电击转 采用 ୩᧕୩ ͱ۪ዶ᥈ጶ 检验其纯度ᤥ
化ྉ 电压 ϟ᥊ ጢ Ҵᖔ电阻 ԡԡ ᖔ电容 ጢ ဂèᖔ电击时 ϓᤫ ᇺᤫ ই 黑芥子酶活力和蛋白浓度测定
间 ࿗ጲ ϟԡ ቝ༁ɯ 至毕赤酵母 ᥈୩ϟϟጢ 感受态细胞ᖔ立即 参考 ۼᑕႿ੫ 等 Џԡ 的方法进行黑芥子酶活力测
