食品科学技术学报 - page 25

作用[6] 。
乳蛋白是乳中的主要营养成分 ,作为一种全价
蛋白质不仅能够提供优质氨基酸, 经过适当可控酶
解后还能释放出生物活性肽, 这些活性肽具有调节
胃肠道运动、 调节免疫、 降血压、抗菌、 清除自由基和
促进矿物元素吸收等多种生物学功能[7 - 8] 。 乳蛋白
肽还具有 DPP鄄4 抑制作用,有研究已经从 茁鄄乳球蛋
白酶解物中分离出了具有抑制 DPP鄄 4 活性的肽
Ile鄄Pro鄄Ala, Val鄄Ala鄄Gly鄄Thr鄄Trp鄄Tyr [9 - 10] 。 酪蛋白
和乳清分离蛋白分别经碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶 、风
味蛋白酶酶解所得酶解物均具有 DPP鄄 4 抑制作
用 [11 - 13] , 但目前尚未见酪蛋白糖巨肽 ( GMP) 及其
酶解物 DPP鄄4 抑制作用的相关报道。
酪蛋白糖巨肽(glycomacropeptide,GMP) 是 资鄄酪
蛋白在胃蛋白酶作用下苯丙氨酸- 蛋氨酸之间的肽
键断裂形成的含有 64 个氨基酸的糖基磷酸肽[14] 。
研究发现,GMP 具有降低人体总胆固醇 、甘油三酯、
血糖、胰岛素水平的能力[15] 。 在太空失重环境中,
机体糖代谢会发生变化,如胰岛细胞胰岛素分泌量
下降以及细胞糖消耗减少等 [16 - 17] 。 基于乳源活性
肽丰富的生物学活性功能以及 GMP 血糖调节能力,
本研究旨在探讨 GMP 及其酶解物对 DPP鄄4 酶的抑
制作用 ,为 GMP 的进一步开发利用提供基础, 也为
GMP 在太空失重环境中的应用提供理论依据。
1摇 材料与方法
1郾 1摇 材料与试剂
木瓜蛋白酶、 DPP鄄 4、 Gly鄄Pro鄄PNA、 Ile鄄Pro鄄Ile
( 又称为 Diprotin A)、TNBS,Sigma 公司; 碱性蛋白
酶, 丹麦诺维信公司;胰蛋白酶、胃蛋白酶, 美国 Am鄄
resco 公司; 酪蛋白糖巨肽, 丹麦 Arla 公司;Tris 粉
末、NaOH( 分析纯)、HCl( 分析纯),北京化工厂 。
1郾 2摇 仪器与设备
iMarkTM Microplate Reader 型酶标仪, 美国 Bio -
RAD 公司;L20 型冷冻干燥机,北京松源华兴有限公
司;DK-8B 型电热恒温水浴锅,上海精宏试验设备
有限公司;FE20 型分析天平, 北京塞多利斯科学仪
器有限公司。
1郾 3摇 方法
1郾 3郾 1摇 GMP 酶解物的制备[18]
利用碱性蛋白酶、 木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、 胰蛋
白酶分别酶解 GMP,酶解条件如表 1。 按底物质量
浓度 50 g / L 称取酪蛋白糖巨肽于室温下充分溶解 2
h,并将恒温水浴锅温度调至各酶的最适温度, 加碱
或酸调节达到酶最适 pH 值, 再按酶与底物质量分
数为 5% 的比例把酶加入在恒温水浴锅中酶解。 酶
解过程中不断加入 1 mol / L NaOH 或 1 mol / L HCl 来
维持酶最适 pH 值, 分别于酶解 0郾 25,0郾 50,0郾 75,1,
2,3,4,5 h 处取样, 最后在 85 益 灭酶 15 min, 冻干
待用。
表 1摇 4 种蛋白酶酶解条件
Tab. 1摇 Hydrolysis conditions of different enzymes
蛋白酶 温度 / 益 最适 pH 总酶解时间 / h
胰蛋白酶 37 8郾 0 5
碱性蛋白酶 55 8郾 5 5
木瓜蛋白酶 55 6郾 0 5
胃蛋白酶 37 2郾 0 5
1郾 3郾 2摇 DPP鄄4 活性测定 [19]
检测 DPP鄄4 活性采用发色底物法,底物选择甘
氨酰脯氨酸对硝基苯胺 (Gly鄄Pro鄄PNA)。 各物质添
加量如表 2。 按照样品或 Diprotin A、DPP鄄 4、 Tris鄄
HCl 缓冲液、Gly鄄Pro鄄PNA 的顺序依次加入 96 孔板,
在 37 益、pH 值为 8郾 0 条件下反应 30 min 后于 405
nm 处用酶标仪测定吸光值。
DPP鄄4 抑制率 = [1 - ( OD 实验组 - OD 空白
组 ) / (OD 阴性对照组 - OD 空白组 )] 伊 100% 。
表 2摇 DPP鄄4 活性测定体系各组分加入量
Tab. 2摇 Adding amount of reactants for DPP鄄4
inhibition assay 滋L
样品组 Diprotin A 阴性对照组 空白对照组
样品 20 — — —
Diprotin A — 2 — —
DPP鄄4 30 30 30 —
Tris鄄HCl 50 68 70 100
Gly鄄Pro鄄PNA 100 100 100 100
1郾 4摇 水解度测定
水解度 (DH) 测定采用三硝基苯磺酸( TNBS)
法 ,样品用 1% 十二烷基硫酸钠稀释后取 0郾 125 mL
先后与 1 mL 磷酸缓冲液、1 mL 0郾 1% TNBS 溶液混
匀在 50 益 条件下水浴避光反应 60 min,用 2 mL 0郾 1
mol / L HCl 终止反应后室温冷却并于 420 nm 下测吸
光值, 见式(1)。
DH = h / htot 伊 100% 。 (1)
02 食品科学技术学报 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 2015 年 3 月