Page 54 - 《食品科学技术学报》2020年第5期
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第 38 卷 第 5 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 陈摇 梦等: 降血压活性卡拉胶钾的肠道菌群调节作用研究                                       4 9


   注肠道内环境的改善、短链脂肪酸(short鄄chain fat鄄                  容物。
   ty acids,SCFAs)的变化以及菌群组成上的差异等,                    1郾 3郾 2摇 短链脂肪酸的测定
   以期从肠道环境及菌群的角度对低分子质量卡拉                                 样品前处理(水提法):取保存于 - 80 益 冰箱的
   胶钾(LCP)降低 SHR 血压的可能机理进行更深一                        LCP 组的盲肠内容物置于冰盒上,冷冻状态下用消

   步的阐释。                                             毒的镊子称取 0郾 3 g 左右置于 2 mL EP 管中,用超纯
                                                     水定容至刻度线,混匀后冷冻离心。 将上清液转移
   1摇 材料与方法                                          至另外的离心管中,注入 60 滋L 2 mg / mL 的磺基水

                                                     杨酸以除去蛋白质,充分混匀后冷冻离心。 取 1 mL
   1郾 1摇 材料与试剂
                                                     上清液,加入异己酸原液 12郾 5 滋L 以保证和标准品
       卡托普利,深圳海王药业有限公司;低分子质量
                                                     中异己酸的浓度一致,混合均匀,冷藏待用。
   卡拉胶钾(分子质量 3郾 5 kDa),本实验室制备; SC鄄
                                                         色谱条件:色谱柱为离子排阻 KC -811 色谱柱
   FAs 标准品、异己酸纯物质原液,西格玛贸易有限公
                                                     (8郾 0 mm 伊 300 mm); 流 动 相 为 体 积 分 数 0郾 01%
   司;脂多糖试剂盒,上海酶联免疫公司;体积分数
                                                     H PO (pH 值 3郾 12),柱温 50 益,流速 0郾 8 mL/ min,
   4% 多聚甲醛固定液,中山康乃欣生物医疗有限公                             3  4
                                                     检测 器 为 紫 外 检 测 器, 波 长 210 nm, 检 测 时 间
   司;地衣酚,上海一研试剂有限公司。
                                                     35 min。
   1郾 2摇 仪器与设备
                                                         短链脂肪酸的测定采用内标法               [9] ,内标物为异
       Milli -Q Reference 型超纯水系统,美国默克密
                                                     己酸,计算见式(1) ~ 式(3)。
   理博公司;XW-80A 型旋涡混合器,海门市麒麟医
                                                                           A
   用仪器厂;Olympus BX41 型荧光显微镜,南京贝登                                        f =  r  摇 。             (1)
                                                                           A
   医疗股份有限公司;1260 型高效液相色谱仪,安捷伦                                               s
                                                         式(1)中,A ,标准品中异己酸的峰面积;A ,待
   科技有限公司; KC-811 型色谱柱,北京恩加壹科技有                                    r                           s
                                                     测样品中异己酸的峰面积。
   限公司。 SPF 级的雄性 SHR 18 只[9 周龄,220 ~260 g,
                                                         则待测样品中相应 SCFAs 的质量浓度 籽 为:
                                                                                             i
   收缩压大于 165 mmHg(1 mmHg = 0郾 133 kPa)],北京
                                                                      A·m    A·A·籽
                                                                                 i
   维通利华实验动物有限公司,实验动物生产许可证                                        籽 = f·  i A  ri  =  r A·A  ri 摇 。  (2)
                                                                  i
                                                                         ri     s  ri
   号:SCXK(京)2016-0011。                                   式(2) 中,A ,待测样品中相应 SCFAs 的峰面
                                                                    i
   1郾 3摇 实验方法                                        积;A ,标准品中相应 SCFAs 的峰面积;籽 ,标准品
                                                          ri                               ri
   1郾 3郾 1摇 动物饲养与血压测定                                中相应 SCFAs 的质量浓度,mg / L。
       18 只 SHR 于 SPF 级屏障环境动物房适应性喂                       则盲肠内容物中 SCFAs 的含量(mg / g)为:
   养 1 周,温度:22 ~ 26 益;湿度:50% ~ 70% ;饲养密                                籽 伊 2 伊 10  - 3
   度:3 只/ 笼。 SHR 的头、背、尾 3 个部位分别被染上                                  w =  i  m     摇 。           (3)
   苦味酸(黄色) 作为区分标记;人为控制光照环境,                              式(3)中,2,样品体积,mL;m,称取的盲肠内容
   保持生存环境 12 h 光照,12 h 黑暗。 根据体重和血                    物的质量,g。
   压平均分为 3 组,每组 6 只,保证组间初始血压平均                       1郾 3郾 3摇 菌群多样性分析
   值尽可能接近。 根据参考文献[8],实验剂量如下:                             针对 16S rRNA 的 V3 ~ V4 区进行 Miseq 扩增
   空白对照( B) 组灌胃蒸馏水,实验 ( LCP) 组灌胃                     子测序。 测序数据经拼接、质控、去接头之后获得优
   LCP[600 mg / (kg·d)],阳性对照(P)组灌胃卡托普                化序列,基于优化序列进行 OTU 聚类,获得 OTU 丰
   利[10 mg / (kg·d)]。 实验持续 6 周,每周定时定点                度表,用于后续生信分析。 对于 Beta 多样性分析,
   测量收缩压(SBP)1 次,完全按仪器的测量方法进                         基于 Bray_Curtis weighted 和 unweighted unifrac 距离
   行操作,等大鼠在黑暗密闭环境完全安静后仪器自                            计算距离矩阵,使用 PCoA 进行结果可视化展示;使
   动读数,每只大鼠测量 5 次,若有相差较大的数值,                         用非参数的 adonis 分析(PerMANOVA) 检测组间差
   当场剔除,保证 5 次测量结果相差不大。 并称重 2                        异是否显著,以及分组因素对组间差异的解释度。
   次以便根据体重随时微调实际灌胃体积。 实验结束                           使用 Welch蒺s t tests 进行不同组间门和属水平物种
   后,乙醚迷晕大鼠,腹主动脉取血, 注意收集盲肠内                          丰度变化的差异分析,使用 Bonferroni 进行多重检
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