Page 76 - 《食品科学技术学报》2026年第1期

Ꭾ ԰ 食品科学技术学报জজজজজজজজজজজজজজজজ জ ԰ԡ԰ᤃ 年 ϟ 月

分别采集细胞图像ᖔ以对比钙离子荧光信号的变化ᤥ ँᤃ 孔板置于荧光倒置显微镜中ᖔ以 ࿗ँԡ Ⴟቝ 作为激
显微镜光学参数设定如下᧥激发滤光片中心波长为 发波长ᖔጢϟ࿗ Ⴟቝ 作为发射波长ᖔ对加样前 ୩ఋऊ᥋ϟ 细
ྉ࿗ँԡ ō԰ԡɯ Ⴟቝଫ发射滤光片中心波长为ྉጢϟ࿗ ōሕԡɯ Ⴟቝᤥ 胞内钙离子荧光值进行测定ᤥ 从加样后 ϟԡ ༁ 开始
使用 ԡ᥊ ϟ ቝᆍ᤟ ᣰ ᓂ ᡱ̀ 值为 Ꭾ᥊ ԰ ጲ Ꭾ᥊ ࿗ 的磷酸盐缓 进行钙离子实时荧光值检测ᖔ每 ϟԡ ༁ 采集一次数
冲溶液ྉ ᡱၤᆍ༁ᡱၤᑕᡷᔀ ᤦࣼ஦஦ᔀʢᔀʛ ༁ᑕ᤟ᔽႿᔀᖔ۪ା୩ɯ 分别配制鲜 据ᖔ持续监测 ԰ԡԡ ༁ᖔ每组设 ሕ 个重复孔ᤥ 根据所记
味肽溶液ྉ 样品组ɯ 和谷氨酸钠 ྉ ቝᆍႿᆍ༁ᆍʛᔽࣼቝ ੫᤟ࣼᡷᑕ᥋ 录的实时荧光数据ᖔ提取各实验组的钙离子荧光信
ቝᑕᡷᔀᖔ ᥘ୩᥈ɯ溶液ྉ 阳性对照组ɯᤥ 阳性对照组选用 号峰值作为最大响应值ᖔ其所对应的时刻记为最大
ᥘ୩᥈ 溶液的终浓度 为 ԡ᥊ ጢԡܦϟ᥊ ԡܦ԰᥊ ԡܦ࿗᥊ ԡܦऐ᥊ ԡ 响应时间ᖔ该时刻所对应的鲜味肽浓度即为最大响
ቝቝᆍ᤟ ᣰ ᓂᖔ这 ጢ 种浓度梯度涵盖了常见的食品中 ᥘ୩᥈ 应浓度ᤥ
的含量范围以及可能的实验研究所需的浓度范围ᤥ 钙离子实时荧光信号强度用相对荧光值的变化
从较低浓度开始逐渐增加ᖔ可以观察到不同浓度下 ᪵Þ
  表示 Џϟ԰૒ ᖔ计算见式ྉϟɯᤥ
对相关反应或指标的影响ᖔ以确定其在实验体系中 Þ ԡ

的作用和效果ᤥ 而 ሕ 种鲜味肽 ྉ ዶ᣽ጶ᣽è᧕ܦ ᓂዶጶᓂ᣽ ᪵Þ Þ ͱ Þ ԡ
ᢉ ᤥ ྉ ϟ ɯ
Þ Þ
以及 ᓂఋè჆ጶ኏ɯ的终浓度为 ԡ᥊ ԰ጢܦԡ᥊ ጢԡܦϟ᥊ ԡܦ԰᥊ ԡܦ࿗᥊ ԡ ԡ ԡ
ቝቝᆍ᤟ ᣰ ᓂᖔ这种梯度则是为了研究不同浓度的鲜味肽 式ྉϟɯ中ᖔÞ 为钙离子实时荧光值ଫÞ 为加样前
ԡ
在与实验体系相互作用时的表现ᤥ 较低浓度可以检 钙离子荧光值ᤥ
测到微量的肽对实验结果的影响ᖔ而较高浓度则能 ϓᤫ ᇺᤫ ᇺই ୩ఋऊ᥋ϟ细胞鲜味受体 ఋϟ኏ϟ ᣰ ఋϟ኏ሕ 的 ቝ኏શዶ
更明显地观察到肽的作用效果ᖔ通过这一系列浓度 表达量测定
的设置ᖔ可以更全面地了解鲜味肽在特定实验条件 ϟ᥊ ሕ᥊ ሕ᥊ ϟজ 鲜味肽细胞毒性测定
下的特性和功能ᤥ ሕ 种鲜味肽的细胞毒性通过 ऊᔀ᤟᤟ ऊᆍࣼႿᡷᔽႿ੫ ᣽ᔽᡷ᥋ऐ
以 ϟ᥊ ԡ ġ ϟԡ ᣰ 孔的细胞密度将细胞铺于 ँᤃ 孔板 ྉ简称 ऊऊ᣽᥋ऐɯ实验进行测定ᖔ从而验证长时间使用
࿗
鲜味肽溶液孵育是否会造成细胞活力下降或
中ᖔ每孔加 入 ँԡ ဂᓂ 完全培养基 ྉϟԡᠮ èା୩ շ ँԡᠮ
死亡 Џϟ࿗૒ ᤥ
᧕ᥘጶᥘ᥋̀ 培养基ɯᤥ 将 ँᤃ 孔板置于 ሕᎮ ቩ 培养箱中ᖔ
࿗
使细胞贴壁 ԰࿗ ၤᤥ 吸除完全培养基ᖔ 每孔加入 细胞均液的制备᧥以每孔 ϟġ ϟԡ 细胞密度将细
ϟԡԡ ဂᓂ 的࿗ဂቝᆍ᤟ ᣰ ᓂ è᤟ࣼᆍ᥋ऐ ዶᥘ 钙离子荧光探针ᖔ完 胞铺于 ँᤃ 孔板中ᖔ于 ሕᎮ ቩ 贴壁 ԰࿗ ၤᤥ 使用 ۪ା୩ 缓
全覆盖细胞ᖔ放入 ሕᎮ ቩ 培养箱中孵育 ሕԡ ቝᔽႿᤥ 孵育 冲液制备 ϟ᥊ ԡ ቝቝᆍ᤟ ᣰ ᓂ 浓度的 ሕ 种鲜味肽溶液ᖔ样品
完成 后ᖔ 吸除钙离子荧光探针ᖔ 用预 温 的 ̀ା୩୩᥋ 组每孔加入 ϟԡ ဂᓂ 鲜味肽溶液ᖔ空白对照组ྉऊᆍႿᡷʢᆍ᤟
̀ᑕႿҴᑪ༁ 平衡盐溶液避光清洗 ԰ 次以去除多余探针ᤥ 组ɯ每孔加入 ϟԡ ဂᓂ 的 ۪ା୩ 缓冲液ᖔሕᎮ ቩ 孵育 ऐၤᤥ
以 ऊऊ᣽᥋ऐ 和完全培养基的体积比为 ϟᨒ ϟԡ 的比
由于 è᤟ࣼᆍ᥋ऐ ዶᥘ 为光敏感探针ᖔ后续操作全程避光ᖔ
避免荧光淬灭影响实验结果 Џϟ԰૒ ᤥ 例配制 ऊऊ᣽᥋ऐ 溶液ᤥ 样品组和 ऊᆍႿᡷʢᆍ᤟ 组每孔均加
将 ँᤃ 孔板置于荧光倒置显微镜下ᖔ以蓝色荧光 入 ऊऊ᣽᥋ऐ 溶液 ϟϟԡ ဂᓂᖔሕᎮ ቩ 孵育 ԰ၤᖔ使用多功能酶
作为激发光源ᖔ于最佳视角拍摄加样前照片和加样 标仪于 ጢ࿗ԡ Ⴟቝ 处测定吸光度值ᤥ 以细胞活力值
ᤃԡ ༁ 时同一位置的照片ྉ加样后照片ɯᤥ ྉᠮ ɯ表示鲜味肽的细胞毒性ᤥ
ϓᤫ ᇺᤫ ԣই ୩ఋऊ᥋ϟ细胞 内 钙 离子实时荧光信号强度的 ϟ᥊ ሕ᥊ ሕ᥊ ԰জ 实时荧光定量 ۪ऊ኏ 的测定
测定 根据鲜味肽细胞毒性实验结果ᖔ选择合适的孵
荧光倒置显微镜无法对于荧光进行实时定量ᖔ 育时长ᖔ使用 ሕ 种鲜味肽对 ୩ఋऊ᥋ϟ 细胞进行孵育ᖔ提
故使用多功能酶标仪对钙离子荧光信号进行实时定 取总 ኏શዶ 并反转录为 ዹ᧕શዶᤥ 反转录体系ྉ԰ԡ ဂᓂɯ
量检测ᖔ以探究不同浓度样品对于 ୩ఋऊ᥋ϟ 细胞内钙 包括᧥࿗ ဂᓂ 的 ጢ ġ ዶ᤟᤟᥋ᔽႿ᥋ᆍႿᔀ ी኏ఋ ୩ࣼᡱᔀʢᥘᔽ଴ᖔϟ ဂᓂ 的
离子荧光信号响应的实时变化 Џϟሕ૒ ᤥ 多功能酶标仪 ጶႿझᢃቝᔀ ᥘᔽ଴ 和 ϟဂᓂ 的总 ኏શዶ 溶液ྉጢԡԡ Ⴟ੫ ᣰ ဂᓂɯᖔ并
具备吸光度ܦ荧光及化学发光等多种检测模式ᤥ 用无核酸酶双蒸水补至 ԰ԡ ဂᓂᤥ 反应程序᧥第 ϟ 步ᖔ
样品组ܦ阳性对照组浓度ᖔ以及细胞在 ँᤃ 孔板 ጢԡ ቩ 条件下反应 ϟጢ ቝᔽႿଫ 第 ԰ 步ᖔऐጢ ቩ 条件下
的铺板操作同 ϓᤫ ᇺᤫ ϓ 节ଫ因 ୩ఋऊ᥋ϟ 细胞属于贴壁细 反应 ጢ༁ᤥ
胞ᖔ故换用黑框透明底 ँᤃ 孔板进行此次实验ᤥ 将 采用 ୩ɟା኏ ᥈ʢᔀᔀႿ 嵌合荧光法进行实时荧光定