Page 48 - 《食品科学技术学报》2020年第5期
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第 38 卷 第 5 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 沈摇 欣等: 壳寡糖对体外诱导的非酒精性脂肪肝细胞模型的降脂机理研究                                    4 3


   集细胞并用预冷的 PBS 洗涤两次。 添加 200 滋L 2%                   0郾 5、1郾 0、2郾 0、3郾 0、4郾 0、5郾 0 mg / mL) 对 HepG2 细胞
   Triton X -100 到每个孔中,并通过超声破碎细胞。                    存活率的影响,实验结果见图 1。 由图 1 可知,与对
   通过 BCA( bicinchonininc acid) 法蛋白定量试剂盒             照组相比,较高质量浓度( > 4郾 0 mg / mL) 壳寡糖处
   测定蛋白浓度,使用甘油三酯、总胆固醇、高低密                            理组中 HepG2 细胞存活率显著降低( P < 0郾 05)。
   度脂肪酸胆固醇和游离脂肪酸试剂盒分别测定相                             因此,本研究选择质量浓度小于等于 4郾 0 mg / mL 的
   应浓度。                                              壳寡糖用于后续实验。
   1郾 3郾 5摇 mRNA 定量
       各组细胞经 1郾 3郾 1 中条件处理 24 h 后,收集细
   胞提取总 RNA,检验合格后使用逆转录试剂盒将总
                             襆            襆
   RNA 合成 cDNA,使用 AceQ         qPCR SYBR    Green
   Master Mix 经实时荧光定量 PCR 仪对 mRNA 进行
               - 驻驻CT
   定量。 采用 2        方法计算 mRNA 的相对量,计算
   公式见式(2)。
       驻CT = 驻CT(试验样品) - 驻CT(基准样品);
     驻CT(试验样品) = CT(试验样品、目的基因) -
                                                       图 1摇 壳寡糖与油酸钠共处理对 HepG2 细胞存活率的影响
              CT(试验样品、内参基因);
                                                        Fig. 1摇 Effect of co鄄incubation of COS and sodium oleate
     驻CT(基准样品) = CT(基准样品、目的基因) -
                                                              on cytotoxicity in HepG2 cells
              CT(基准样品、内参基因)。                  (2)
                                                     2郾 2摇 壳寡糖对 HepG2 细胞模型脂质积累的影响
   式(2)中,CT 值是每个反应管内的荧光信号到达设
                                                         选用不同质量浓度(0郾 1、0郾 5、1郾 0、4郾 0 mg / mL)
   定的域值时所经历的循环数。
                                                     壳寡糖与油酸钠共同处理 HepG2 细胞 24 h,通过油
   1郾 3郾 6摇 蛋白质含量测定
                                                     红 O 染色测定各实验组细胞内总脂质含量,结果见
       各组细胞经 1郾 3郾 1 中条件处理 24 h 后,收集细
                                                     图 2。 从图 2 可以看出,与模型组相比,不同质量浓
   胞提取总蛋白,使用 BCA 法蛋白定量试剂盒测定蛋
                                                     度的壳寡糖显著降低了胞内总脂质积累量,并在一
   白浓度。 制备好的蛋白样品经电泳分离、转膜,在室
                                                     定质量浓度范围呈现剂量依赖。 因为 0郾 1 mg / mL
   温下,将膜放在含有质量分数 5% 脱脂牛奶的 TBST
                                                     与 0郾 5 mg / mL 壳寡糖处理组之间脂积累量未出现
   (tris buffered saline Tween) 溶液中封闭 1 h,然后置
   于一抗(CD36、DGAT2、LXR琢、PXR、PPAR酌) 中孵育                显著 性 差 异, 所 以 后 续 实 验 选 用 0郾 5、 1郾 0、 4郾 0
                                                     mg / mL三个作用效果较优的质量浓度。
   过夜(4 益)。 用 TBST 洗膜 3 次,将膜放入二抗中,
                                                         对各组细胞胞内脂质生化指标进行测定,结果
   在室温下孵育 1 h。 通过化学发光 ECL( enhanced
                                                     见图 3。 由图 3 可以发现,油酸钠组细胞胞内甘油
   chemiluminescence)方法分析并用 Tanon 4200 成像
                                                     三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和游离脂肪酸
   系统进行图像数据分析。
   1郾 4摇 数据处理                                        的含量与空白对照组相比显著升高(P < 0郾 05),证
       每个实验至少重复 3 次,数据表示为平均值                         明 NAFLD 细胞模型构建成功。 不同质量浓度壳寡
                                                     糖处理组细胞胞内甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇
    依 SD。采用 SPSS 软件通过单因素方差分析和 Dun鄄
                                                     和游离脂肪酸的含量显著下降,呈现剂量依赖;其中
   can 多重比较分析实验组之间的统计结果。 P <
                                                     4郾 0 mg / mL 的壳寡糖处理组甘油三酯、低密度脂蛋
   0郾 05 被认 为 具 有 统 计 学 意 义, 并 用 不 同 的 字 母
                                                     白胆固醇和游离脂肪酸的含量分别下降了 22% 、
   表示。
                                                     41% 和 76% ,具有统计学意义(P < 0郾 05)。 不同质
   2摇 结果与分析                                          量浓度壳寡糖的处理对胞内总胆固醇和高密度脂蛋
                                                     白胆固醇的水平无显著性影响,推测壳寡糖可能介
   2郾 1摇 壳寡糖对 HepG2 细胞的细胞毒性分析                        导了甘油三酯合成及脂肪酸吸收通路相关基因的表
       通过 MTT 法测定了不同质量浓度壳寡糖(0郾 1、                    达,从而达到降脂效果。
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