Page 47 - 《食品科学技术学报》2020年第5期
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4 2                                     食品科学技术学报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇     摇 2020 年 9 月


   中具有重要的作用。                                         GAAG鄄3忆;Reverse:5忆鄄AGCTGGAATTACCGCGGCT鄄3忆
       研究表明,不同分子量(1 000 Da 和 3 000 Da)               1郾 2摇 仪器与设备
   的壳寡糖可以减少油酸诱导的 NAFLD 模型中脂质                             Synergy HT 型酶标检测仪,美国 BioTeK 公司;
   的积累   [17] ;并且通过对壳寡糖混糖及单一聚合度                      5427 R 型高速低温离心机,Eppendorf 中国有限公
   2 ~ 6 的壳寡糖进行降脂活性筛选,发现低聚合度的                        司;Ti - U 型 倒 置 荧 光 显 微 镜, 日 本 Nikon 公 司;
   壳寡糖降脂效果优于壳寡糖混糖               [18] ,但是目前壳寡         CFX96 型 qPCR 仪、170-4481 型电泳仪、Tanon4200
   糖改善非酒精性脂肪肝病的潜在保护机制方面的研                            型成像系统,美国 Bio -Rad 公司;1379 型生物安全
   究还不够完善。 因此,本研究拟通过对脂肪酸吸收                           柜,美国 Thermo 公司。
                                                     1郾 3摇 实验方法
   和甘油三酯合成通路的相关基因和蛋白进行测定,
   进一步探究壳寡糖的体外降脂活性和潜在的作用机                            1郾 3郾 1摇 细胞培养和处理
   制,希望为将壳寡糖进一步开发成具有降脂护肝效                                HepG2 细胞选用含有质量分数为 10% 的胎牛
                                                     血清的高糖培养基(DMEM),在 37 益和体积分数为
   果的膳食补充剂提供理论依据。
                                                     5% 的 CO 培养箱中培养,每 2 ~ 3 d 进行传代培养。
                                                              2
   1摇 材料与方法                                              将油酸钠溶于含质量分数 1% 的 BSA 牛血清白
                                                     蛋白的高糖培养基中,配制成终浓度为含 0郾 2 mmol/ L
   1郾 1摇 材料与试剂
                                                     油酸钠培养基。 将细胞铺板在 96 孔/ 24 孔/ 6 孔板
       HepG2 人肝癌细胞株,购于中科院细胞库;壳                       中,培养 24 h 后进行分组处理:将含 1% BSA 牛血
   寡糖(COS,脱乙酰度逸95% ),由华东理工大学发酵
                                                     清白蛋白的高糖培养基作为空白对照组;将含有
   工 业 分 离 提 取 技 术 研 发 中 心 自 制; DMEM
                                                     0郾 2 mmol/ L 的油酸钠-BSA 的高糖培养基作为模型
   (dulbecco蒺s modified eagle蒺s medium) 高糖培养基、       组;将不同剂量壳寡糖与油酸钠- BSA 的高糖培养
   PBS(phosphate buffer saline) (pH 值 7郾 4)、PS (pen鄄
                                                     基同时处理作为共同处理组。
   icillin鄄streptomycin solution) (双抗)和抗荧光淬灭封        1郾 3郾 2摇 细胞存活率测定
   片剂,生工生物工程(上海)股份有限公司;BSA(al鄄                           通过 MTT 法测定细胞存活率。 将 HepG2 细胞
   bumin bovine V)牛血清白蛋白 (不含脂肪酸) ,北                  与10 滋L 5 mg / mL 的 MTT 在 37 益 孵育 4 h,除去溶

   京索莱宝科技有限公司;油红 O(Oil Red O)和 MTT                   液后,每孔加入 150 滋L 的二甲基亚砜,使用酶标仪
   (噻唑蓝) ,美国 Sigma 公司;甘油三酯、总胆固醇、                     在 490 nm 下测量吸光度。 细胞存活率计算方法见
   高低密度脂蛋白胆固醇及游离脂肪酸检测试剂盒,                            式(1)。
   南京 建 成 科 技 有 限 公 司; CD36、 PPAR酌、 PXR 和                             细胞存活率 =
   LXR琢 抗体,美国 Protein tech 公司;DGAT2 抗体,美                  (OD 样品  - OD 调零 ) / (OD 空白  - OD 调零 ) 伊100%。 (1)
   国 Affinity 公司。 引物序列由生工生物工程有限公                     式(1)中,OD    样品  表示样品组吸光度;OD        调零 表示调零
   司合成:                                              组吸光度;OD      空白 表示空白组吸光度。
   CD36: Forward: 5忆鄄GAGAACTGTTATGGGGCTAT鄄3忆;        1郾 3郾 3摇 油红 O 染色
                                                                            5
   Reverse:5忆鄄TTCAACTGGAGAGGCAAAGG鄄3忆                    将 HepG2 细胞以 10 个细胞/ 孔的密度接种在
   DGAT2: Forward: 5忆鄄CGAAAGCCACTTCTCATACA鄄          24 孔板中培养 24 h 后,用磷酸盐缓冲液洗涤 3 次,
   3忆; Reverse:5忆鄄TGCCTACTACTGCCCTCAC 鄄3忆            并在室温下用质量分数 4% 多聚甲醛固定 30 min。
   PPAR酌:Forward:5忆鄄TTGCAGTGGGGATGTCTCAT鄄3忆;         除去多聚甲醛后,用磷酸盐缓冲液洗涤 3 次,然后每
   Reverse:5忆鄄TTTCCTGTCAAGATCGCCCT 鄄3忆               孔加 0郾 5 mL 油红 O 溶液染色,20 min 后用 PBS 洗
   LXR琢: Forward: 5忆鄄GATCGAGGTGATGCTTCTGGAG鄄         涤两次,并在荧光显微镜下观察拍照。 每孔加 200
   3忆;Reverse:5忆鄄CCCTGCTTTGGCAAAGTCTTC鄄3忆            滋L 异丙醇萃取油红 O 染料 10 min,并通过酶标仪在
   PXR: Forward: 5忆鄄GGCCACTGGCTATCACTTCAA鄄3忆;        510 nm 下测量吸光度。
   Reverse:5忆鄄TTCATGGCCCTCCTGAAAA鄄3忆                 1郾 3郾 4摇 细胞脂质水平的测定
   18S  RNA: Forward: 5忆鄄CGGCTACCACATCCAAG鄄              将 HepG2 细胞按 1郾 3郾 1 中条件处理 24 h 后,收
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