Page 93 - 《食品科学技术学报》2020年第5期

8 8 食品科学技术学报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 2020 年 9 月

摇 摇 表 1摇 PDE9A 蛋白质纯化回收率 酶活力结果见图 4。 从图 4 可以看出,该酶的最适
Tab. 1摇 Recovery rate of PDE9A protein 反应缓冲体系的 pH 值为 7郾 0,在 pH 值 6郾 0 ~ 9郾 0,
during purification 相对酶活力均能达到 50% 以上。 由此可知,获得的

Ni -NTA Q-Sepharose Sephacryl S300 PDE9A 蛋白更适合在碱性缓冲体系中发挥作用,这
m(菌体) /
m(蛋白 回收 m(蛋白 回收 m(蛋白 回收
g 可能与人体的碱性环境有关,也证明该酶能够在较
质) / mg 率/ % 质) / mg 率/ % 质) / mg 率/ %
宽泛的 pH 值范围内发挥作用。
7郾 86 278 100 100 36 70 25
可知,3郾 6 滋g / mL PDE9A 蛋白的水解率达 77郾 27% ,
且酶活力达到 7郾 76 U,说明低质量浓度 PDE9A 蛋白
可以水解 cGMP,具有较高生物活性。 Rui 等 [24] 纯
化的 PDE9A 蛋白的 EC 值为 0郾 083 47 mg / mL,相比
50
较而言,本实验表达以及纯化的蛋白酶活性更强。
3郾 2 滋g / mL 的 PDE9A 蛋白可水解 65% 底物,因此该
质量浓度可用于筛选具有 PDE9A 蛋白抑制作用的

天然活性物质。
图 4摇 PDE9A 最适反应 pH 值的测定
表 2摇 不同含量 PDE9A 对 cGMP 水解情况 Fig. 4摇 Detection of optimum reaction pH value for PDE9A
Tab. 2摇 Hydrolysis of cGMP by different 摇
2 +
2郾 6摇 Mg 和 DTT 对酶活力的影响分析
concentrations of PDE9A
磷酸盐缓冲液(20 mmol/ L,pH 值 7郾 0)和 Tris -
- 1
籽(蛋白质) / (滋g·mL ) 水解率/ % 酶活力/ U
HCl 缓冲液 (20 mmol/ L, pH 值 8郾 0) 反应 体 系 中
3郾 0 40郾 56 12郾 33
2 +
Mg 和 DTT 对 PDE9A 蛋白活性的影 响 见 图 5。
3郾 2 65郾 88 8郾 10
DTT 具有较强的还原能力和巯基激活能力,在 Tris -
3郾 6 77郾 27 7郾 76
HCl 缓冲液反应体系中可将 PDE9A 蛋白相对酶活
2郾 4摇 PDE9A 蛋白最适反应温度分析 性提高 16郾 8% ,说明 PDE9A 蛋白中含有较多的半
PDE9A 蛋白的最适反应温度测定结果见图 3。 胱氨酸。 金属离子是影响酶活性的重要因素之一,
由图 3 可以看出,该酶的最适反应温度为 37 益。 Fisher 等 [25] 证 明 Mg 2 + 、 Mn 2 + 和 Ca 2 + 均 可 提 高
30 益的相对酶活力为 60% ,45 益 的相对酶活力为 PDE9A 蛋 白 的 酶 活 力。 实 验 结 果 表 明, Mg 2 + 在
40% ;而在低温 4 益、高温 50 益 及以上相对酶活力 Tris -HCl 缓冲液中可将相对酶活力提高 34郾 6% ,与
降至 20% 以下。 由此可以看出,PDE9A 蛋白最适反 文献报道一致,但在磷酸盐缓冲液中无作用。 在
应温度与人体正常温度相同,且其在 25 ~ 45 益 有较 Tris -HCl 缓冲液体系中,Mg 2 + 和 DTT 共同作用可
为广泛的作用温度范围,说明获得的 PDE9A 蛋白能

够适应较为宽泛的反应温度。

图 3摇 PDE9A 最适反应温度的测定
Fig.3摇 Detection of optimum reaction temperature for PDE9A
2 +
摇 图 5摇 Mg 与 DTT 对 PDE9A 酶活力的影响
2郾 5摇 PDE9A 蛋白最适反应 pH 值分析
Fig. 5摇 Effects of magnesium ion and DTT on PDE9A
PDE9A 蛋白在不同 pH 值反应缓冲液中的相对 enzyme activity