Page 91 - 《食品科学技术学报》2020年第5期
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8 6                                     食品科学技术学报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇     摇 2020 年 9 月


   北卡莱罗纳大学教堂山分校柯衡明教授馈赠。                              入牛凝血酶酶切 1郾 5 h。 10 000 r/ min 离心 20 min
   1郾 1郾 2摇 实验试剂                                     后,将上清液蛋白溶液加入 Q -Sepharose 进行分离
       DNA 分子质量标准品 Marker、10 x PCR buffer、           纯化和 SDS -PAGE 检测。 Q-Sepharose 纯化后的蛋
   标准蛋白质 Marker,美国 Thermo 公司;乙二胺四乙                   白质经超滤浓缩至 10 mL         [17] 。 浓缩后的蛋白质加入
   酸钠(EDTA),北京西陇化工有限公司;三羟甲基氨                         Sephacryl S300 中进行纯化,洗脱收集的 PDE9A 蛋

   基 甲 烷 ( Tris - Base )、 氨 苄 青 霉 素 ( ampicillin,    白测定其 280 nm 处的吸光度并进行 SDS -PAGE 和
   AMP)、氯霉素,美国 Sigma 公司;IPTG、cGMP,美国                 Native -PAGE 检测。 将蛋白收集液超滤浓缩至 10
   Amoresco 公司;蛋白胨、酵母浸粉,北京奥博星生物                      mg / mL 以上并冷冻保存       [18] 。
   技术有限公司;氯化钠,国药集团;琼脂,北京博奥拓                          1郾 3郾 3摇 PDE9A 酶活力测定

   达科技有限公司。                                              PDE9A 酶活测定参考 Hou 等         [19] 。 反应体系为
   1郾 2摇 仪器与设备                                       20 滋mol/ L cGMP 底物、3郾 2 滋g / mL PDE9A 纯化蛋白
   1郾 2郾 1摇 实验仪器                                     和 20 mmol/ L Tris - HCl 缓 冲 液 ( pH 值 8郾 0 ),
       French Press SL -650D 型超声破碎仪,南京顺              30 益反应 30 min 后采用 HPLC 测定底物的含量,根
   流仪器公司;层析实验冷柜,北京博医康实验仪器有                           据底物峰面积的减少量计算 PDE9A 蛋白的水解率。
   限公司;JP61M/ HV-85 型高压灭菌锅,日本 Hiraya鄄                1 min 内转化 1 滋mol cGMP 所需要的酶量定义为 1
   ma 公司;PHS -3D 型 pH 计,上海仪表有限公司;                    个酶活力单位(U),相对酶活力定义为各条件测得
   Thermo Forma Class域A2 型净化工作台,美国 Ther鄄             的蛋白水解率相对于最高水解率的百分比。 每组实
   mo 公司;5810R 型高速离心机,德国 Eppendorf 公                 验做 3 次平行实验。
   司;1260 型高效液相色谱仪,美国 Agilent 公司。                        色 谱 检 测 条 件: 色 谱 柱 Intertsil ODS - 3
   1郾 2郾 2摇 蛋白纯化柱                                    (4郾 6 mm 伊 250 mm,5 滋m)。 流动相 A 为 0郾 02 mol/ L
       30230 型 Ni - NTA agarose,德国 Qiagen 公司;        KH PO ,流动相 B 为甲醇, 洗脱条件为体积分数
                                                        2  4
                            TM                 TM
   17-0510-01 型 Q-Sepharose   Fast Flow、Sephacryl    82% A:18% B。 检测波长 252 nm,柱温 30 益,流速
   S300,美国 GE Healthcare Life 公司。                    1 mL/ min,进样量 20 滋L   [20] 。
   1郾 3摇 实验方法                                        1郾 3郾 4摇 最适反应温度的测定
   1郾 3郾 1摇 重组 pET15b -PDE9A 质粒诱导表达                      按照 1郾 3郾 3 中的反应条件,分别在 4、25、30、
       将 pET15b -PDE9A 质粒转化至 E. coli BL21 感          37、45、50、60、70 益 下反应 30 min 后, 测 定 其 酶
   受态细胞中 37 益 培养 12 ~ 16 h。 挑菌、 接种到                  活力   [21] 。
   2xYT 培 养 基 中 采 用 IPTG 低 温 ( 15 益) 诱 导 表           1郾 3郾 5摇 最适 pH 值的测定
   达  [13] 。 诱导结束后在 4 益、10 000 r/ min 条件下离               配置不同 pH 值的缓冲液作为反应缓冲液(pH
   心 5 min 集菌,并分别在诱导前和诱导结束后测定                        值为 3郾 0、4郾 0、5郾 0 的柠檬酸盐缓冲液,pH 值为 6郾 0、

   600 nm 处的吸光度,按照等菌体量取样并进行SDS -                     7郾 0 的磷酸钠盐缓冲液、pH 值为 8郾 0、9郾 0 的 Tris -
   PAGE 检测。                                          HCl 缓冲液),缓冲液的浓度均为 20 mmol/ L。 根据
   1郾 3郾 2摇 PDE9A 蛋白纯化                               1郾 3郾 3 的方法,在最适温度下反应 30 min 后测定
   1郾 3郾 2郾 1摇 菌体破碎                                  PDE9A 蛋白的酶活力        [22] 。
       参考文献[14],表达菌体按照质量比 1颐 10 加                    1郾 3郾 6摇 Mg 2 +  离子和 DTT 对酶活力的影响
   入提取液悬浮液并进行超声破碎(工作时间 5 s,间                             在磷酸盐缓冲液(20 mmol/ L,pH 值 7郾 0)、Tris -
   歇时间 5 s,共工作 30 min)3 次,分别对总蛋白质、上                  HCl 缓冲液(20 mmol/ L,pH 值 8郾 0) 反应体系中分
   清液蛋白、沉淀蛋白进行 SDS -PAGE 检测              [15]  。     别添加 10 mmol/ L Mg   2 +  和(或)1 mmol/ L DTT,在最
   1郾 3郾 2郾 2摇 基于重组蛋白多重性质的分离纯化                       适温度下反应 30 min 后测定 PDE9A 的酶活力。
       上清液蛋白利用 Ni - NAT 琼脂糖树脂亲和柱                     1郾 4摇 数据处理
   纯化并在 280 nm 处测定纯化蛋白质的吸光度,将                            SDS -PAGE 电泳图应用 Image 软件进行分析,
   A 等于 1 定义为蛋白质质量浓度 1 mg / mL,并进行                   酶活特性测定数据采用 SPSS 和 Origin 软件进行数
    280
   SDS -PAGE 检测   [16] 。 Ni -NAT 纯化收集溶液中加            据分析。
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