Page 92 - 《食品科学技术学报》2020年第5期

第 38 卷 第 5 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 王郅媛等: 环核苷酸磷酸二酯酶 PDE9A 的体外表达、纯化与酶活特性分析 8 7

2郾 2摇 PDE9A 蛋白的分离纯化分析
2摇 结果与分析 外源表达菌体破碎以及 Ni -NAT、Q -Sepharose

和 Sephacryl S300 分离纯化结果见图 2。 从图 2(a)
2郾 1摇 pET15b-PDE9A 质粒诱导表达分析
可以看出,经过超声破碎后,上清液中的目的蛋白含
对诱导 0 h 和 24 h 的蛋白表达菌体进行 SDS -
量远高于沉淀中目的蛋白含量,说明此蛋白质水溶
PAGE 检测,结果如图 1。 低温诱导培养可以减少包
性较强,但仍形成少量的包涵体。 经过 Ni -NAT 亲
涵体的形成,促进可溶性蛋白的表达并维持蛋白质
和层析纯化后,PDE9A 蛋白纯度达到 80% 以上,说
的稳定结构 [23] 。 由图 1 可知,IPTG 低温(15 益) 诱
明 PDE9A 蛋白与 Ni - NAT 有较强的结合能力且
导 24 h 后,出现一条明显的蛋白质条带,蛋白质条
PDE9A 蛋白能够得到有效纯化(图 2(b))。 牛凝血
带的大小与 PDE9A 目的蛋白(约 41 kDa) 相近,由
酶可在 1郾 5 h 内有效切除蛋白质中的 His -tag 标签,
此可说明该诱导条件可增加 PDE9A 蛋白表达含量
且经过 Q - Sepharose 纯化目的蛋白的纯度达 95%
且平均 1 L 培养基可得到 3郾 125 g 外源表达菌体。
(图 2(c))。 浓缩蛋白加入 Sephacryl S300 进行进
一步 纯 化, 此 时 杂 合 蛋 白 的 含 量 小 于 5% , 证 明
Sephacryl S300 分子筛纯化系统可以进一步去除杂
蛋白,提高蛋白质的纯度(图 2(d))。
PDE9A 经过 Sephacryl S300 纯化后继续浓缩并
检测蛋白质稳定性。 Native -PAGE 结果显示蛋白质
基本没有凝聚现象,主蛋白质条带占 80% 以上,表
明 PDE9A 蛋白在此分离纯化条件不易形成多聚体
且维持较好的生物学活性,具有较强的稳定性(图 2
(e))。
纯化过程蛋白质回收率结果见表 1。 结果表
M:标准蛋白质 Marker;1:诱导 0 h;2:诱导 24 h。 明,Q -Sepharos 纯化后蛋白质的回收率为 36% ,而
图 1摇 PDE9A 蛋白不同诱导时间的 Sephacryl S300 纯化后蛋白质回收率为 25% ,说明
SDS-PAGE 结果 Q-Sepharos 纯化 过 程 中 损 失 大 量 蛋 白 质。 经 过
Fig. 1摇 SDS鄄PAGE results of PDE9A protein at different
Ni -NAT、Q- Sepharos 和 Sephacryl S300 纯化后,最
induction time
摇 摇
摇

M:标准蛋白质 Marker;1:超声破碎总蛋白;2:离心上清液蛋白;3:离心沉沉淀蛋白;N:Ni -NAT 纯化;E:酶切 1郾 5 h;Q:Q鄄Sephacrose 纯化的
蛋白质;S:Sephacryl S300 纯化的蛋白质;N1:取样 3 滋L;N2:取样 10 滋L。
图 2摇 PDE9A 蛋白的分离纯化凝胶电泳结果
Fig. 2摇 Electrophoresis results of PDE9A protein after different purification
摇
终 1 g 表达菌体可纯化获得 8郾 9 mg 蛋白质,证明该 2郾 3摇 PDE9A 蛋白酶活性分析
诱导条件能够获得大量的目的蛋白,并能经过多重 利用 HPLC 检 测 体 系 测 定 不 同 质 量 浓 度
纯化手段得到高纯度的蛋白质。 PDE9A 蛋白对 cGMP 的水解情况,见表 2。 由表 2