Page 76 - 《食品科学技术学报》2020年第4期
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第 38 卷 第 4 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 刘晓慧等: 偏甘油酯脂肪酶 PrLip 的重组表达及酶学性质表征                                7 1


       娄地青霉(Penicillium roqueforti) 是一种广泛存           培养至生长对数期中期,按照体积比 1颐 10 进行扩大
   在于自然界的真菌,可用于生产蓝纹奶酪,为食品安                           培养,相同条件下培养 60 h。
   全级的菌株,近年来已被全基因测序                 [15] 。 研究从其          在 4 益 下,10 000 r / min 离心 20 min,收集发酵
   基因组筛选出一个脂肪酶基因,命名为 prlip,对其进                       上清液,获得粗酶液;用 0郾 45 滋m 微孔滤膜过滤粗
   行重组表达、纯化及酶学性质表征,旨在丰富工业用                           酶液,将过滤后的上清液置于冰上,用 10 kDa 的膜
                                                     包浓缩,并用 20 mmol/ L Tris鄄HCl(pH 值 8郾 0) 缓冲
   脂肪酶的资源并提供脂肪酶研究基础。
                                                     液等体积换盐 5 次。 使用 Q Sepharose Fast Flow 阴
   1摇 材料与方法                                          离子交换柱对粗酶液进行纯化,用 20 mmol/ L Tris鄄
                                                     HCl 缓冲液(pH 值 8郾 0) 平衡,将换盐后的粗酶液
   1郾 1摇 材料与试剂
                                                     上样,先用含 80 mmol/ L 氯化钠的 20 mmol/ L Tris鄄
       毕赤 酵 母 ( Pichia pastoris) X33 及 表 达 载 体
                                                     HCl 缓冲液(pH 值 8郾 0)洗脱,去除杂蛋白,再用含
   pGAPZ琢A,本实验室保存;基因引物、质粒提取试剂
                                                     250 mmol/ L氯化钠的 20 mmol/ L Tris鄄HCl 缓冲液
   盒、Bradford 蛋白检测试剂盒、博来霉素、蛋白 mark鄄
                                                     (pH 值 8郾 0) 将目的蛋白质洗脱。 利用 12% SDS鄄
   er,生工生物工程(上海) 股份有限公司。 Q Sepha鄄
                                                     PAGE 凝胶电泳分析重组 PrLip 的纯化情况。
   rose 层析填料, 瑞典 GE Healthcare 公司 ( 中国广              1郾 3郾 3摇 脂肪酶 PrLip 酶活力测定
   州);三月桂酸甘油酯(质量分数 95% )、琢,琢蒺鄄二月                         采用滴定甘油二酯乳化液的方法测定脂肪酶水

   桂精(质量分数 95% )、单月桂酸甘油酯(质量分数                        解活力    [16]  。 取 5 mL 0郾 02 mol/ L 缓冲液及4 g 甘油
   90% )、 亚 麻 酸 ( 质 量 分 数 约 70% ), 美 国 Sigma鄄        二酯乳化液(1 g 的甘油二酯和 3 g 质量分数 4% 聚
   Aldrich 公司;甘油二酯油(质量分数 51郾 4% TAG、                 乙烯醇,用均质机均质至体系均一)于50 mL锥形瓶
   48郾 6% DAG),实验室自制。 其他试剂皆为分析纯。                     中,45 益恒温水浴锅中预热 5 min,加入适量酶液,
   1郾 2摇 仪器与设备                                       恒温反应 5 min 后马上加入 15 mL 体积分数 95% 乙
       Waters 1525 型高效液相色谱仪,美国 Waters 公              醇破乳,终止反应。 加入 3 滴酚酞指示剂,用 0郾 05
   司;AKTA Purifier 蛋白纯化系统,瑞典 GE Healthcare           mol/ L 氢氧化钠溶液滴定游离脂肪酸,记录消耗的
   公司;Spectral Max M2e 型多功能酶标仪,美国伯腾                  氢氧化钠体积。 空白对照为反应体系预热后不加酶
   仪器有限公司。                                           液,同样操作后加入 15 mL 95% 乙醇及等体积的灭
   1郾 3摇 实验方法                                        活酶液。
   1郾 3郾 1摇 重组毕赤酵母的构建                                    脂肪酶酶活力定义为:在上述测定条件下,单位
       根据 Gene Bank 数 据 库 中 公 开 的 娄 地 青 霉            时间(1 min)水解甘油二酯产生 1 滋mol 游离脂肪酸
   ( Penicillium  roqueforti ) 编 码 的  prlip  基 因     所需要的酶量,为一个酶活力单位,U。
   (CDM30754郾 1),委托生工生物工程(上海) 股份有                    1郾 3郾 4摇 脂肪酶 PrLip 酶学性质测定

   限公司合成基因序列,并克隆到表达载体 pGAPZ琢A                            1) 脂肪酶 PrLip 最适 pH 值及 pH 耐受性的测
   中。 重组质粒 pGAPZ琢A鄄prlip 线性化后电转化至毕                   定。 选择 pH 值 4郾 0、5郾 0、6郾 0、7郾 0、8郾 0、9郾 0 六个测

   赤酵母 X33 感受态,通过博来霉素抗性 YPD(yeast                    试点( pH 值 4郾 0、5郾 0 为柠檬酸盐 缓 冲 液,pH 值
   extract peptone glucose)培养基(10 g / L 酵母提取物、       6郾 0、7郾 0 为磷酸盐缓冲液,pH 值 8郾 0 为 Tris鄄HCl
   20 g / L 蛋白胨、20 g / L 葡萄糖) 培养平板筛选转化               溶液,pH 值 9郾 0 为甘氨酸鄄氢氧化钠溶液),30 益
   子,利用菌落 PCR 鉴定获得阳性菌株。 将阳性菌株                        下测定酶活力,以相应 pH 值下的最高酶活力为
   接种到 5 mL 含 100 滋g / mL 博来霉素的 YPD 液体培              100% ,其余以相对酶活力表示。 将脂肪酶 PrLip
   养基中,30 益、200 r/ min 振荡培养 60 h 后, 进行               置于不同 pH 值(4郾 0 ~ 9郾 0) 的缓冲液中,4 益 孵育
   SDS鄄PAGE 电 泳 检 测 及 酶 活 鉴 定, 获 取 重 组               2 h 后测定残余酶活力,检测脂肪酶 PrLip 的 pH 耐
   pGAPZ琢A鄄prlip鄄X33 酵母表达菌株。                         受性。 以孵育前的酶活力为 100% ,其余以相对酶
   1郾 3郾 2摇 重组脂肪酶 PrLip 的表达及纯化                       活力表示。
       从甘油管中吸取 200 滋L 菌液接种于 50 mL                        2) 脂肪酶 PrLip 最适温度及热稳定性的测定。
   YPD 种子培养基中,于 30 益、200 r/ min 恒温摇床中                在最适 pH 值,不同温度(20 ~ 60 益)条件下检测脂
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