Page 77 - 《食品科学技术学报》2020年第4期
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7 2                                     食品科学技术学报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇     摇 2020 年 7 月


   肪酶 PrLip 的酶活力。 以相应温度下的最高酶活力                       由 Origin Pro 8郾 0 软件处理和分析。
   为 100% ,其余以相对酶活力表示。 将适量的脂肪
   酶 PrLip 置于不同温度(35、40、45 益) 的油浴锅,每                 2摇 结果与分析
   隔一定的时间取样测定残余酶活力,检测脂肪酶
                                                     2郾 1摇 脂肪酶 PrLip 的序列分析
   PrLip 的热稳定性。 以热处理前的酶活力为 100% ,
                                                         根据脂肪酶 G鄄X鄄S鄄X鄄G 保守五肽等序列特征,
   其余以相对酶活力表示。
                                                     从娄地青霉基因组中发现了一个假定的脂肪酶序列
       3) 金属离子、有机溶剂及表面活性剂对脂肪酶
   PrLip 酶活力的影响。 将脂肪酶 PrLip 分别孵育在                    命名 prlip [17] 。 该序列包含一个完整的开放阅读框,
                                                     由 849 bp 核苷酸组成,编码 283 个氨基酸,预测蛋
   终浓度为 5 mmol/ L 金属离子(NiCl、ZnSO 、CuSO 、
                                        4      4
   MgCl 、CaCl 、MnCl 、CoCl 、FeCl ) 溶液、体积分数            白质分子质量为 31 kDa。 通过序列比对分析,PrLip
       2     2      2     2     3
                                                     与其他偏甘油酯脂肪酶 PCL、PcMdl 和AOL 的相似
   30% 有机溶剂(甲醇、乙醇、异丙醇)、体积分数 1%
                                                     度分别为 80郾 65% 、81% 和 60郾 85% ,提示它可能具
   表面活性剂(SDS、曲通 X鄄100、吐温 20、吐温 80)中,
   4 益孵育 2 h 后测定残余活力。 以不添加其他离子                       有类似偏甘油酯脂肪酶的催化功能;但其与偏甘油
   或分子的酶活力为 100% 。                                   酯脂肪酶 SMG1 和 MgMDL2 的序列相似度较低,仅
       4) 脂肪酶 PrLip 对甘油酯的底物特异性测定。                    为 19郾 86% 和 22郾 11% 。 PrLip 与已报道的偏甘油酯
   通过分别水解三月桂酸甘油酯、琢,琢蒺鄄二月桂精、单                         脂肪酶的序列比对结果见图 1。 PrLip 与其他偏甘
   月桂酸甘油酯 3 种标准品来检验其底物特异性。 取                         油酯脂肪酶有一致的保守五肽序列(GHSLG),预测
   0郾 5 g 甘油酯乳化液(1 g 甘油二酯和 3 g 质量分数                  其催化三联体为 Ser145、Asp199、His259,其中活性
   4% 聚乙烯醇,均质至体系均一)于 4 mL 螺口瓶,加                      位点 Ser145 位于保守五肽序列中。
   入 450 滋L 缓冲液(20 mmol/ L,pH 值 7郾 0) 和 100 U        2郾 2摇 脂肪酶 PrLip 表达与纯化结果分析
   酶液。 在 40 益、500 r/ min 的油浴锅中水解反应                       利用基因工程使毕赤酵母(pGAPZ琢A鄄prlip) 胞
   24 h,脂肪酸产物通过高效液相色谱(high perform鄄
                                                     外高效表达重组脂肪酶 PrLip,通过 Q Sepharose Fast
   ance liquid chromatography, HPLC) 检测。 此外,通        Flow 阴离子交换层析柱,利用不同浓度的氯化钠洗
   过亚麻酸和甘油进行酯化反应,进一步验证其底物
                                                     脱液分离,获得目的蛋白质。 PrLip 蛋白质表达与纯
   特异性。 反应总体系为 2 g(甘油与亚麻酸摩尔比为
                                                     化结果见图 2 及表 1。 SDS鄄PAGE 检测显示,重组脂
   4颐 1),200 U 冻干 PrLip 酶粉,在 40 益、500 r/ min 的
                                                     肪酶 PrLip 分子质量约为 31 kDa,与预测的分子质
   油浴 锅 中 反 应, 每 隔 一 段 时 间 取 样, 进 行 HPLC
                                                     量一致,同时表明重组 PrLip 在细胞内翻译过程没
   分析。
                                                     有发生明显的糖基化修饰。 1郾 5 L 发酵液最终可纯
   1郾 3郾 5摇 水解及酯化反应产物的测定
                                                     化得到蛋白质 49 mg,回收率为 38郾 89% ,纯化倍数
       水解及酯化反应后的脂肪酸及甘油酯由配备
                                                     为 4郾 37 倍(表 1)。 纯化的重组蛋白质应用于后续
   Waters 2414 型示差折光检测器的高效液相色谱仪
                                                     的生化性质研究。
   进行检测,液相色谱柱购于美国 Phenomenex Corpo鄄
                                                     2郾 3摇 脂肪酶 PrLip 的酶学性质分析
   ration 公司,规格为 250 mm 伊 4郾 6 mm,5 滋m。 色谱条
                                                     2郾 3郾 1摇 pH 值对 PrLip 酶活力的影响
   件为:流速 1 mL/ min,进样体积 10 滋L,柱温箱温度
                                                         pH 值对 PrLip 酶活力的影响见图 3(a)。 在 pH
   30 益,流动相为正己烷-异丙醇-甲酸(体积比 18颐
                                                     值 7郾 0 时活性最高,而在 pH 值 4郾 0 和 9郾 0 的溶液
   1颐 0郾 003)
   1郾 3郾 6摇 脂肪酶 PrLip 同源建模                           中,酶活力受抑制。 研究 PrLip 对不同 pH 值的耐受
                                                     性,结果发现在 pH 值 4郾 0 和 5郾 0 孵育 2 h 后,其相
       采用 Swiss鄄Model 在线网站( https:椅swissmod鄄
   el. expasy. org / ),以 PCL(PDB ID:5CH8) 为模板预       对残余酶活低于 60% ,在 pH 值 8郾 0 和 9郾 0 中残留
   测脂肪酶 PrLip 的三维结构,从结构上分析蛋白质                        活性超过 90% ,这说明 PrLip 在碱性环境中的稳定
                                                     性要优于酸性环境(图 3(b))。 该结果与其他已报
   稳定性。
   1郾 4摇 数据处理                                        道的偏甘油酯脂肪酶性质相似(表 2),已报道的偏
       实验数据为 3 次平行实验的平均值,所有数据                        甘油酯脂肪酶最适 pH 值均在 6郾 0 ~ 7郾 5,且大部
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