长紫外检测器和
Rev. A. 09. 03
色谱工作站
),
美国
安捷伦科技有限公司
;
超纯泵机
,
北京德泉兴业商贸
有限公司
;PHS -3D
型
pH
计
,
上海三信仪表厂
;
溶
剂过滤器
,
北京江海科仪科技有限公司
;KQ5200DE
型数控超声波清洗器
,
昆山市超声仪器有限公司
;
SHB-B95
型循环水式多用途真空泵
,
郑州长城科工
贸有限公司
;
分析天平
,Sartorius
公司
;4K15
型离心
机
,
美国
Sigma
公司
;F500AG
型高速多功能粉碎机
,
北京汇海科仪仪器有限公司
。
1郾 3摇
实验方法
1郾 3郾 1摇
样品处理
根据参数文献
[12]
进行样品前处理
。
将山黧
豆磨碎
,
过
40
目筛
。
准确称取
1 g
山黧豆粉
,
加入
40 mL
提取溶剂
,
渍
(
乙醇
)
为
10% ,
控制提取温度为
60 益,
籽
(
山黧豆粉
) = 0郾 025 g / mL (
m
(
山黧豆粉
) 颐
V
(
提取溶剂
) = 1 g颐 40 mL),
超声波处理
1 h,
静置一
晚
,
在
4 000 r / min
离心
15 min,
取上清提取液
,
将提
取液保存于
4 益。
1郾 3郾 2摇
标准溶液和样品衍生化
吸取
25 滋L 17
种氨基酸混合标样溶液
,25 滋L
籽
(茁鄄ODAP) = 0郾 5 mg / mL
标样溶液
,
加入
200 滋Lc
(NaHCO
3
) = 0郾 5 mol / L, 200 滋Lc ( PNZ鄄Cl ) = 5
mmol / L,
超声
2 min,
过
0郾 45 滋m
滤膜并进样
。
取上清提取液
200 滋L,
加入
200 滋Lc(NaHCO
3
)
= 0郾 5 mol / L,200 滋Lc( PNZ鄄Cl) = 5 mmol / L,
超声
2
min,
过
0郾 45 滋m
滤膜并进样
。
1郾 3郾 3摇
色谱条件的优化
[13 - 15]
分别考察流动相梯度洗脱条件
,
乙酸
-
乙酸钠
缓冲溶液
pH
值
、
柱温
、
流动相流速等液相色谱条件
对
茁鄄ODAP
及其他
17
种氨基酸的分离效果的影响
。
1郾 3郾 4摇
样品提取条件的优化
1郾 3郾 4郾 1摇
乙醇体积分数
取
5
支试管
,
分别加入
1 g
山黧豆粉
,
按
渍
(
乙
醇
)
分别为
10% ,30% ,50% ,70% ,90% ,
加入
10 mL
提取溶剂
,
在
100 W
功率下超声
1 h,
常温静置一晚
,
在
4 000 r / min
转速下离心
15 min,
取上清提取液
,
分
别衍生化处理
,
分析
,
每个样品做三次平行实验
。
1郾 3郾 4郾 2摇
山黧豆粉质量浓度
取
6
支试管
,
分别加入
1 g
山黧豆粉
,
渍
(
乙醇
)
为
10% ,
按
籽
(
山黧豆粉
)
为
0郾 10, 0郾 05, 0郾 03,
0郾 025,0郾 02,0郾 017 g / mL
加入
10 mL
提取溶剂
,
在
100 W
功率下超声
1 h,
常温静置一晚
,
在
4 000
r / min
转速下离心
15 min,
取上清提取液
,
分别衍生
化处理
,
分析
,
每个样品做三次平行实验
。
1郾 3郾 4郾 3摇
提取温度
取
5
支试管
,
分别加入
1 g
山黧豆粉
,
渍
(
乙醇
)
为
10% ,
按
籽
(
山黧豆粉
) = 0郾 10 g / mL
加入
10 mL
提取溶剂
,
在
100 W
功率下超声
1 h,
在水浴温度分
别为
30,40,50,60,70 益
条件下提取
2 h,
静置一晚
,
在
4 000 r / min
转速下离心
15 min,
取上清提取液
,
分
别衍生化处理
,
分析
,
每个样品做三次平行实验
。
2摇
结果与分析
2郾 1摇
衍生化条件的选择
目前用于
HPLC
分析的柱前衍生化试剂主要有
9鄄
芴基甲基
-
氯甲酸酯
(9鄄fluorenylmethyl chlorofor鄄
mate,FMOC)
[16]
、
异硫氰酸苯酯
( phenyl isothiocya鄄
nate,PITC)
[17]
、2,4鄄
二硝基氟苯
(2,4鄄dinitrofluoro鄄
benzene,FDNB)
[18]
、6鄄
氨基喹啉
鄄N鄄
羟基丁二酰亚胺
氨基 甲 酸 酯
( 6鄄aminoquinoly鄄N鄄hydroxysuccinimidy
carbamate,AQC)
[19]
以及丹磺酰氯
( dansyl chloride,
Dansyl鄄Cl)
等
[20]
。
但这些衍生化试剂均需要精确控
制多种反应条件
,
衍生化操作复杂
,
衍生化时间长
,
衍生化后的产物不稳定
。
由于
PNZ鄄Cl
是一种定量
检测生物胺和非蛋白质氨基酸的稳定的衍生化试
剂
。
衍生化反应完成在超声条件和适宜的温度下只
需
6 min,
与之前的柱前衍生化提取方法相比
,
这种
方法快速
、
简便
,
测定结果准确
,
衍生产物一定时间
内稳定
,
可连续测定
[21]
。
2郾 2摇
色谱条件的优化
较佳色谱条件是色谱柱为
Ultimate XB - C18
(4郾 6 mm 伊 150 mm,5 滋m),
流动相乙腈和乙酸
-
乙
酸钠缓冲溶液
( pH
值
= 4郾 6),
梯度洗脱程序
0 ~ 5
min
渍
(
乙腈
)25% ,5 ~ 30 min
渍
(
乙腈
)25% ~ 90% ,
流速
0郾 8 mL / min,
柱温
30 益,
检测波长
300 nm。
2郾 3摇
样品提取条件的优化
由于
茁鄄ODAP
及其他游离氨基酸的提取含量与
峰面积呈正相关
,
所以可以用峰面积大小来表示其
提取效率高低
。
2郾 3郾 1摇
乙醇体积分数对
茁鄄ODAP
及氨基酸提取效
率的影响
取
5
支试管
,
分别加入
1 g
山黧豆粉
,
按
渍
(
乙
醇
)
分别为
10% ,30% ,50% ,70% ,90% ,
加入
10 mL
提取溶剂
,
在
100 W
功率下超声
1 h,
常温静置一晚
,
在
4 000 r / min
转速下离心
15 min,
取上清提取液
,
分
34
第
33
卷 第
2
期
摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
李小波等
:
山黧豆中
茁鄄ODAP
及其他氨基酸的提取和
HPLC
分析
