Page 70 - 《食品科学技术学报》2020年第4期

第 38 卷 第 4 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 易国富等: 大豆肽对果蝇睡眠的影响 6 5

管中,每个指管装 6郾 5 mL,在紫外灯下照射 30 min; 纸,白纸上面就是果蝇的头、腿、翅、触角,再将白纸
注入培养瓶中,每个培养瓶 25 mL,在紫外灯下照射 上的样品倒入 20 目的筛子,筛子截留果蝇的头部。
30 min。 然后盖上橡胶塞,并放在 4 益 的冰箱中待 将果蝇头部置于冻存管中,放入液氮备用。
用 [23] 。 1郾 3郾 6摇 果蝇头部 RNA 提取和 RT鄄qPCR 测量
1郾 3郾 4摇 果蝇的睡眠监控 将收集的果蝇头部样品每组 30 只,使用液氮研
取 20 日龄雄性果蝇在二氧化碳麻醉台上麻醉 磨,加入 TRIzol 试剂裂解样品并根据试剂盒说明书
后,分为 4 组,每组 32 只,其中一组为空白组,另外 提取果蝇头部总 RNA。 将 RNA 样品 1 滋g 用 M鄄
3 组添加 2、4、8 mg / mL 的大豆低聚肽。 剂量设定是 MLV 逆转录酶试剂盒反转录为 cDNA,进一步使用

根据成年人体重 70 kg 的每日蛋白质需求是60 ~ SYBR Green Mix 试剂盒进行荧光定量 PCR,使用
70 g 粗蛋白,作为优质蛋白源营养补充约每日需要 RT鄄qPCR 仪检测目的基因 mRNA 表达水平。 RT鄄
[10] 。 培养基
10 g / d 的量,优质蛋白补充系数为 1 / 7 qPCR 反应程序为:95 益 下预变性 10 min(1 个循
配方中蛋白质的含量约为 29 mg / mL,故大豆低聚肽 环),在 95 益下 10 s,60 益下 1 min 条件下进行 40 个
作为优质蛋白源添加到培养基的量为 4 mg / mL 的 循环扩增,收集 Ct 值数据后采用 2^ - 驻驻Ct 法进行
剂量,在 4 mg / mL 的基础上试验添加了 2 mg / mL 和 数据分析 [26] ,使用 GAPDH 基因作为内参。 表 1 为
8 mg / mL 浓度梯度进行研究 [24 - 25] ,分别为高剂量组
检测使用的引物信息 [27] 。
(8 mg / mL )、 中 剂 量 组 ( 4 mg / mL )、 低 剂 量 组
(2 mg / mL)。每个监测管中装 1 只果蝇,一端塞上能 表 1摇 果蝇基因引物序列
透气的海绵,另一端附上 0郾 5 cm 的培养基或额外添 Tab. 1摇 Drosophila gene primer sequences
加 SBP 的培养基并用蜡封以防止失水风干。 采用 引物名称 引物序列
动物行为分析系统 VideoTrack,在 12 / 12 h 明暗的条 per 上游引物 5忆鄄ACACCATCGCGTCTTTCAGG鄄3忆
件下监测果蝇睡眠,20 日龄 21:00 放入检测管中, per 下游引物 5忆鄄ATTCGCGTGTTCCGGCTCTG鄄3忆
先让果蝇适应 12 h,分析数据从第 21 日 9:00 至第 tim 上游引物 5忆鄄CAACACTACCAACCCAACGTCC鄄3忆
26 日 9:00 的睡眠数据,把监测玻璃管固定到检测 tim 下游引物 5忆鄄GAGCGTGTGCCGAGGTGG鄄3忆
板上,每 5 min 记录一次数据,如图 2。 clk 上游引物 5忆鄄ACGAGAGCGACGACAAGGATG鄄3忆
clk 下游引物 5忆鄄GGCTATCGTGGACTTCAGGACC鄄3忆
cyc 上游引物 5忆鄄GCGAAAGCTGGACAAACTGACT鄄3忆
cyc 下游引物 5忆鄄CCGTTGAATGGATGTAAGCTGC鄄3忆
gad 上游引物 5忆鄄ATGTCGCTGAATCCCAACGG鄄3忆
gad 下游引物 5忆鄄TCAGCAGGAACTCCCGTGTC鄄3忆
tph 上游引物 5忆鄄CTTCGGCGATATGGTGTGGT鄄3忆
tph 下游引物 5忆鄄TTGAATCCTGGATGGTCGGC鄄3忆
gdh 上游引物 5忆鄄GAACCTGAACCACGTCTCGT鄄3忆
图 2摇 果蝇在动物行为分析系统中的睡眠监控图
gdh 下游引物 5忆鄄TCCAGGGACTCTTGAACGGA鄄3忆
Fig. 2摇 Drosophila sleep monitoring chart in animal
hdc 上游引物 5忆鄄AACTCCATGCCTTCCCTAC鄄3忆
behavior analysis system
hdc 下游引物 5忆鄄CCCAGCCAGTTCATCACTA鄄3忆
摇
1郾 3郾 5摇 果蝇头部取样
gapdh 上游引物 5忆鄄GGTCCTTCGGGCAAACTG鄄3忆
选取日龄 20 日雄性果蝇,在当日 21:00,在培
gapdh 下游引物 5忆鄄CCTTAGCCTTGATCTCATCGTA鄄3忆
养基中(共 4 个组:空白组和 SBP 的 3 个剂量组,每
组 50 只)培养 48 h 后,即 22 日晚上 21:00,取待测 1郾 3郾 7摇 果蝇头部 5鄄HT 的测量
果蝇通过二氧化碳麻醉,并装在冻存管,迅速放入液 从液氮罐中取出装有果蝇头的冻存管,每组 30
氮罐中,5 min 后取出迅速用力摇晃,使其充分破碎, 只,加入 0郾 5 mL 的生理盐水,匀浆,3 000 r/ min 离心
倒入 40 目的实验室标准筛 ( 筛子提前用液氮冷 10 min,取上清,使用 5鄄HT ELISA 试剂盒,每组 3 个
却),筛子截留的就是果蝇的躯体,筛子下方放白 平行,在酶标仪 450 nm 的波长下测量。