Page 69 - 《食品科学技术学报》2020年第4期
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6 4                                     食品科学技术学报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇     摇 2020 年 7 月


   人的睡眠特征       [16]  ,因此,利用果蝇遗传学的优势,在               公司; Infinite 200 Pro Nanoquant 型 酶 标 仪, 瑞 士
   20 d 时研究果蝇的睡眠对老年人睡眠具有重要的参                         Tecan 公司。
   考意义。 果蝇睡眠的调控是通过生物钟系统和神经                           1郾 3摇 实验方法
   递质系统协同作用完成的            [17] 。 目前,研究报道了果           1郾 3郾 1摇 SBP 的制备

   蝇的十多个生物钟基因,其中 period( per)、timeless                   配置 w = 2% 大豆分离蛋白(soybean protein iso鄄
   (tim)、 clock ( clk)、 cycle ( cyc) 4 个为核心的钟基       late,SPI)水溶液,按照 4 000 U/ g 的加酶量添加酶,
   因 [18] 。 调控睡眠的神经递质,主要有促进睡眠的 酌鄄                    分别添加碱性蛋白酶和中性蛋白酶,反应温度 55
   氨基丁酸( GABA)、五羟色胺(5鄄HT),促进觉醒的                      益、pH 值为 7、反应时间 4 h。 然后在温度 85 益的条
                             [19 - 21]
   谷氨酸 ( Glu) 和 组 胺 ( His)        , 以 及 果 蝇 脑 内      件下灭活 15 min,用陶瓷微滤膜和超滤膜过滤,在
   GABA 的限速酶———谷氨酸脱羧酶 ( glutamic acid                40 益、60 MPa 条件下过滤,得到的滤液在 - 40 益、
   decarboxylase,GAD)、5鄄HT 的限速酶———色氨酸羟               压强 12 Pa、时长 30 h 的条件下冷冻干燥,得到 SBP。
   化 酶 ( tryptophan hydroxylase, TPH )、 Glu 的 限 速    SBP 的制备过程见图 1。

   酶———谷 氨 酸 脱 氢 酶 ( glutamic dehydrogenase,
   GDH)、His 的限速酶———组氨酸脱羧酶 ( histidine
                     [22]
   decarboxylase,HDC)   。
       本研究以果蝇为实验模型,采用动物行为分析
   系统监测 SBP 对 20 日龄雄性处女果蝇睡眠行为的
   影响,并检测 SBP 对生物钟基因( per、tim、clk、cyc)
   与参与调控睡眠神经递质合成限速酶的基因(gad、
   tph、gdh、hdc) 的影响,旨在探索 SBP 对老年果蝇睡
   眠营养干预的影响。

   1摇 材料与方法
                                                                   图 1摇 大豆肽的制备流程
   1郾 1摇 材料与试剂                                             Fig. 1摇 Preparation process of soybean peptides
                                                      摇
       大豆分离蛋白,山东御馨生物科技有限公司;碱                         1郾 3郾 2摇 SBP 分子量分布的测定
   性蛋白酶(200 U/ mg)、中性蛋白酶(100 U/ mg),上                    通过凝胶过滤色谱法在 LC20A 上进行测量。
   海源叶生物科技有限公司;野生型 Canton S 品系黑                      使用的色谱柱为 TSK鄄GEL G2000SWXL(300 mm 伊
   腹果蝇(Drosophila melanogaster),北京大学生命科              7郾 8 mm 伊 5 滋m)。 制备的肽质量浓度为 1 mg / mL,

   学学院;TRIzol 试剂,美国 Life Technologies 公司;M鄄          所 有 用 于 测 量 分 子 量 的 标 准 品 质 量 浓 度 均 为
   MLV 逆 转 录 酶 试 剂 盒, 美 国 Progema 公 司;5鄄HT           1 mg / mL。 进样前,样品和标准品均通过 0郾 22 滋m
   ELISA 试剂盒,中国江莱生物;SYBR Green Mix PCR               过滤器过滤。 进样量为 20 滋L,流动相 V(水)颐 V(乙
   试剂盒,赛默飞世尔(中国)公司。                                  腈) 颐 V ( 三 氯 乙 酸 ) = 80 颐 20 颐 0郾 1, 流 速 为
   1郾 2摇 仪器与设备                                       0郾 5 mL/ min,检测波长为 220 nm。

       人工气候培养箱,德国 Binder 公司;VideoTrack               1郾 3郾 3摇 果蝇基础培养基的配置
   动物行为分析系统,法国 Viewpoint 公司;Milli - Q                    将培养瓶和指管清洗干净,与橡胶塞一同放入
   Integral 5 型纯水仪, 美国 Millipore 公司; Alpha1 -        灭菌锅中灭菌,温度 120 益,时间 30 min。 冷却后在
   2LD 型冷冻干燥机,德国 Christ 公司;LightCycler96             紫外灯下照射 30 min。 在 5 L 的电饭煲中首先加入
   型 RT鄄qPCR 仪,瑞士 Roche 公司;LC20A 液相(色谱               蒸馏水 1郾 65 L,加入蔗糖 31郾 62 g、葡萄糖 63郾 24 g、
   柱为 TSK鄄GEL G2000SWXL, (7郾 8 mm 伊 300 mm 伊         酵母 32郾 19 g、琼脂 10郾 6 g,并不断搅拌升温煮沸,加
   5 滋m)),日本 Shimadzu 公司;0郾 22 滋m 陶瓷微滤膜、             入玉米粉 77郾 7 g,再煮 15 ~ 20 min,保温 15 min(保
   2 000 Da 超滤膜,江苏久吾高科技股份有限公司;                       温 13 min 时 加 入 山 梨 酸 钾 2 g, 无 水 氯 化 钙
   YXQ-LS -75S域型高压灭菌器,上海博讯实业有限                       0郾 726 g),充分搅匀,并将其通过食物注入枪注入指
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