统的分离
、
培养方法难以培养或目前的技术还不能
够对其进行培养
,
相应的分析也难以进行
,
只有低于
30%
的细菌可经过目前的体外培养技术获得
[6 - 7]
。
本实验采用分子生物学手段如变性梯度凝胶电泳
(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE),
实时
荧光定量
( real鄄time fluorescent quantitative polymer鄄
ase chain reaction,PCR(RT鄄PCR))
等方法研究粪便
中菌群
DNA
的组成变化情况
,
分析葡萄籽原花青素
对营养肥胖模型大鼠肠道菌群微生态环境的影响
。
1摇
材料与方法
1郾 1摇
主要材料与试剂
葡萄籽原花青素
(
纯度
逸95% ),
天津尖峰天然
产物公司
;
琼脂糖
,
美国赛默飞世尔公司
;DNA
回收
试剂盒
、DL2000 DNA Marker、dNTP、10 伊 buffer、Taq
DNA
聚合酶
,
宝生物工程
(
大连
)
有限公司
;
引物合
成
,
上海生物工程有限公司
;
去离子甲酰胺
、
丙烯酰
胺
、
尿素
、
过硫酸铵
、
四甲基二乙胺
,
北京拜尔迪生物
技术有限公司
;
染料
SYBR Green 域,
宝生物工程
(
大连
)
有限公司
。
1郾 2摇
仪器与设备
MyCycler
型
PCR
仪
,
变性梯度凝胶电泳仪和
iQ5
型实时荧光定量
PCR
仪
,
美国
Bio鄄Rad
公司
;
Image Quant 300
型凝胶成像仪
,
美国
GE
公司
。
1郾 3摇
实验方法
1郾 3郾 1摇
动物实验
SPF
级
Wistar
雄性大鼠
80
只
(90 依 10) g,
购自
北京华阜康生物科技股份有限公司
。
饲养于
SPF
级动物房
,
动物房温度
25 益
左右
,
湿度约
60% ,
光
照
10 ~ 12 h / d,5
只
1
笼
。
将
80
只
Wistar
雄性大鼠
随机分为
2
大组
,
一组
70
只作为模型组
,
另一组
10
只作为正常组
。
正常组和模型组分别给予基础饲料
和高脂饲料
、
花生
、
蛋黄喂养
。
造模期间大鼠自由摄
食
、
饮水
。
模型组高于正常组体重
20%
时
,
认为造
模成功
,
进行分组给药
。
给药期间
,
高
、
中
、
低剂量组
分别按
400,250,100 mg / (kg·d)
的剂量以无菌水为
溶剂给大鼠灌胃葡萄籽原花青素
,
阳性对照组灌胃
低聚果糖
1 g / (kg·d),
模型对照和正常组灌胃无菌
水
。
灌胃
6
周后
,
收集大鼠粪便样本至
- 80 益
冰箱
保存
。
1郾 3郾 2摇
粪便细菌总
DNA
的提取
称量约
200 mg
的粪便样本
,
加入
10 mL 0郾 1
mol / L,pH
值为
7郾 0
的无菌磷酸钠缓冲液中
,
充分震
荡悬浮
5 ~ 10 min,500 r / min
离心
5 min,
收集上清
液
。
重复该步骤
2 ~ 3
次
,
上清液
10 000 r / min
离心
10 min。
收集沉淀
,
将沉淀悬浮于
10 mL
的缓冲液
中
,10 000 r / min
离心
5 min,
洗涤沉淀
,
重复
2 ~ 3
次
,
最后收集沉淀
。
在菌体沉淀中加入
570 滋L TE
buffer,
反复吹打使之悬浮
,
加入
30 滋L 10%
的十二
烷基磺酸钠和
10 滋L
蛋白酶
K,
混匀后
37 益
温育
1
h;
加入
100 滋L 5M NaCl,
充分混匀加入
80 滋L ,65 益
预热的十六烷基三甲基溴化铵裂解液
,
混匀后
65 益
温育
10 min;
加入等体积的酚
/
氯仿
/
异戊醇
(25颐 24颐 1),
混匀
,12 000 r / min
离心
10 min,
直至有机相和水相
间不再有蛋白质
;
转移上清液至新的
1郾 5 mL EP
管
中
,
加入约
0郾 7
倍体积的异丙醇
,
轻轻混匀沉淀
DNA
至少
1 h,12 000 r / min
离心
5 min;
弃上清液
,
沉
淀用
70%
的乙醇
1 mL
洗涤
,12 000 r / min
离心
10
min,
弃上清液
,
重复一次
;
干燥后加
30 滋L TE buff鄄
er,
轻弹管壁使其混匀
, - 20 益
保存
。
1郾 3郾 3摇
DGGE
条件的确定
采用通用引物扩增
16S rDNA
基因
V3
可变区
。
扩增引物序列
(
上游引物
341fGC:5 爷鄄CGCCCGC鄄
CGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGC
CTACGGGAGGCAGCAG鄄3 爷。
下游引物
518r: 5 爷鄄
ATTACCGCGGCTGCTGG鄄3爷)
目的片段基因
200 bp。
PCR
反应扩增体系
(25 滋L):0郾 13 滋L Taq DNA
聚合
酶
(5 U / 滋L),2郾 5 滋L 10 伊 buffer(Mg
2 +
Plus), 2 滋L
dNTPs(
各
2郾 5 mM),
上下游引物各
0郾 5 滋L,DNA
模
板
0郾 5 滋L,
加无菌双蒸水将体积补足至
25 滋L。
采
用降落
PCR
反应程序
:94 益
预变性
4 min;94 益
变性
1 min,65 益
退火
1 min,72 益
延伸
1 min,
执行
20
个
循环
,
每个循环退火温度降低
0郾 5 益;94 益
变性
1
min,55 益
退火
1 min,72 益
延伸
1 min,
再执行
5
个
循环
。
将琼脂糖凝胶电泳检测扩增合格样品进行复
原条件
PCR(50 滋L)
扩增
,
滴入
0郾 25 滋L Taq DNA
聚
合酶
(5 U / 滋L),5郾 0 滋L 10 伊 buffer(Mg
2 +
Plus),4 滋L
dNTPs(
各
2郾 5 mM),
上下游引物各
1 滋L,DNA
模板
1 滋L,
加无菌双蒸水将体积补足至
50 滋L。
反应体
系
:94 益
预变性
3 min;94 益
变性
1 min,55 益
退火
1
min,72 益
延伸
1 min,
进行
5
个循环
;72 益
维持
5
min。
将琼脂糖凝胶电泳检测合格样品进行
DGGE。
DGGE
采用
7郾 5%
的聚丙烯酰胺凝胶
,
变性梯度
范围
25% ~ 55% ,
上样量为
40 滋L
样本和
10 滋L
loading buffer,
电泳缓冲液为
1 伊 TAE,
电压
45 V,60
04
食品科学技术学报
摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
摇 2015
年
9
月
