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第 36 卷 第 2 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 曹永强等: 一株嗜热链球菌乳糖酶的分离纯化及酶学特性研究                                      4 3


   骤。 嗜热链球菌是一种原核微生物,链球菌属                      [7] ,  1郾 3郾 2摇 乳糖酶活力的测定
   它常与保加利亚乳杆菌共同用于酸奶生产,二者之                            1郾 3郾 2郾 1摇 ONP 的标准曲线
   间由于存在共生作用,可以大大减少工业流程所需                                6 支 100 mL 容量瓶中分别加入 0郾 0、3郾 0、6郾 0、
   时间  [8]  。 研究食源性嗜热链球菌产乳糖酶,一方面                     9郾 0、12郾 0、15郾 0 mL 的 ONP(0郾 01 mol/ L) 溶液,去离
   可以保证乳糖酶的安全性,另一方面,可提高菌株的                           子水定容至 100 mL,分别加入 25 mL 的碳酸钠溶
                                                     液,混匀后用磷酸盐缓冲液定容。 紫外分光光度计
   工业使用价值。
       不同来源的微生物 茁鄄半乳糖苷酶的酶学性质                         测定每组在 420 nm 处的吸光值。 以 ONP 浓度为横
   有很大差异,其生产和纯化工艺是影响酶广泛应用                            坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。
                                                     1郾 3郾 2郾 2摇 酶活力测定方法
   的关键步骤     [9] 。 因此,研究可批量工业化应用的产
   乳糖酶微生物、乳糖酶高产菌和低成本的纯化方法                                取 1 mL 酶液,37 益 水浴 5 min,快速加入 5 mL
   具有重要意义。 对乳糖酶酶学特性的研究,也可为                           预热到 37 益的 ONPG 溶液,晃动混匀,37 益 反应 10
                                                     min,后加入 2 mL 的碳酸钠终止反应,冷却后于 420
   乳糖酶生产应用提供切实可行的理论依据。
                                                     nm 下测定吸光值       [11] 。 空白组:在添加 ONPG 前先
   1摇 材料与方法                                          加入 2 mL 碳酸钠溶液。
                                                     1郾 3郾 3摇 单因素实验测定影响乳糖酶产量因素
   1郾 1摇 菌种与试剂                                           对影响嗜热链球菌产乳糖酶的 9 个因素(包括
       嗜热链球菌 GST鄄6 菌株(st. GST鄄6),现保存于                培养基的碳源及其浓度、氮源及其浓度、接种量、发
                                                     酵温度、发酵时间、培养基初始 pH 值、金属离子)分
   本课题组实验室;邻硝基苯鄄茁鄄D 半乳糖苷(2鄄Nitro鄄
   pHenyl鄄beta鄄D鄄galactopyranoside鄄ONPG)、 邻 硝 基 苯    别进行研究。 以产乳糖酶活力为指标,以 M17 培养
   酚(2鄄NitropHenol鄄ONP)、碳酸钠、氯化钠、十二水合                 基为基础培养基,将 M17 培养基中的碳源(葡萄糖)
   磷酸氢二钠、两水合磷酸二氢钠,均为分析纯,国药                           分别以等量的葡萄糖、乳糖、麦芽糖和蔗糖替换;选
   集团化学试剂有限公司;M17 液体培养基(1 L)有大                       取乳糖质量浓度分别为 5、10、15、20、25 g / L;将 M17
                                                     培养基中的氮源(大豆蛋白胨) 分别以等量的大豆
   豆蛋白胨(3郾 3 g)、酪蛋白胨(3郾 3 g)、鱼蛋白胨(3郾 3
                                                     蛋白胨、鱼蛋白胨和酪蛋白胨替换;选取大豆蛋白胨
   g)、酵母浸粉(2郾 5 g)、牛肉膏(5 g)、吐温 80 (500
                                                     质量浓度分别为 5、10、15、20、25 g / L;选取接种量分
   滋L)、葡萄糖(5 g)、乳糖(5 g)、七水硫酸镁(0郾 2 g)、
                                                     别为 1% 、2% 、3% 、4% 、5% (其他发酵条件为发酵
   抗坏血酸钠(1郾 5 g)、茁鄄甘油磷酸二钠(12 g);磷酸
                                                     温度 42 益、发酵时间 8 h、pH 值为 7);选取发酵温
   盐缓冲液的配方,参考 GB / T 8276—1999。
                                                     度分别为 37、39、42、45、55 益(其他发酵条件为接种
   1郾 2摇 实验仪器
                                                     量1%、发酵时间8 h、pH 值为7);选取发酵时间分别为
       CR21G芋型立式高速冷冻离心机,日本 HITA鄄
                                                     6、8、10、12、16 h(其他发酵条件为接种量 1%、发酵温度
   CHI 公司;MLS鄄3750 型高压蒸汽灭菌器,日本三洋
                                                     42 益、pH 值为 7);选取培养基初始 pH 值分别为 3、4、
   公司;U3900 型紫外分光光度计,日本 HITACHI 公
                                                     5、6、7、8(其他发酵条件为接种量 1%、发酵温度 42 益、
   司;S20 数显 pH 计,梅特利 托利多仪器有限公司;
                                                     发酵时间8 h);将 M17 培养基中的金属离子(七水硫酸
   THZ鄄D 型电热恒温培养箱,上海一恒仪器科技有限
                                                     镁)分别以等量的磷酸二氢钾、一水合硫酸锰、氯化钙
   公司。
                                                     和七水合硫酸亚铁替换。
   1郾 3摇 实验方法                                        1郾 3郾 4摇 响应面试验设计
   1郾 3郾 1摇 粗酶液制备                                        结合单因素实验,以培养基初始 pH 值、接种
       菌种活化接种 M17 培养基中,42 益 恒温培养 8                   量、乳糖浓度为自变量,以乳糖酶活力为响应值,根
   h。 取 5 mL 发酵液,在 4 益 以 10 000 r/ min 离心 10         据响应面优化分析原理(Box鄄Behnken, BBD),通过
   min,收集菌体。 用 1 mL 磷酸盐缓冲液冲洗 2 次,再                   Design鄄Expert 软件设计响应面实验,研究 st. GST鄄6
   加入 4 mL 磷酸盐缓冲液,悬浮后加入 0郾 5 mL 已经                   产乳糖酶的最佳发酵条件            [12]  。
   预热到 37 益的溶菌酶(10 mg / mL),涡旋混匀后,37                 1郾 3郾 5摇 乳糖酶的制备及提纯
   益水浴保持 10 min, 加 入 0郾 5 mL 的 氯 化 钠 溶 液             1郾 3郾 5郾 1摇 硫酸铵分级沉淀
                        [10]                             粗酶液经超声破碎,在 4 益 以 10 000 r/ min 离
   (4 mol/ L),静置 50 min    。
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