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2 8 食品科学技术学报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 2018 年 3 月

接种,但却是发酵过程中的优势菌种。 因此,了解传 1郾 2郾 2摇 高质量序列的生物信息学分析
统奶酪中的细菌群落组成,获得优势菌群 [5] ,了解 应用 QIIME ( quantitative insights into microbial
其发酵机理,同时挖掘新的微生物资源,对传统奶酪 ecology)软件对得到的高质量序列进行生物信息学
产品的工业化、标准化生产和益生菌开发利用具有 分析。 用 PyNAST [12] 进行校准、排齐,在序列 100%
重要的意义,但目前针对俄罗斯卡尔梅克共和国传 相似性下进行 UCLUST [13] 归并,建立无重复的 16S
统奶酪样品中细菌多样性的研究却少之又少。 rRNA 序列,在给定相似度 97% 的水平上划分分类
454 焦磷酸测序技术被广泛应用于许多发酵产 操作单元(operational taxonomic units,OTU)。 将去
品中微生物多样性的分析,例如发酵蔬菜、发酵乳以 除含有嵌合体序列的 OTU 序列使用 RDP(ribosomal
及奶酪等 [6 - 9] 。 本研究应用 6 份俄罗斯卡尔梅克共 database project) [14] 和 Greengenes(Version_3郾 8) [15]
和国传统奶酪样品的 454 焦磷酸测序数据,通过生 数据库进行序列同源性比对,并在分类学的门、纲、
物信息学分析,以地域和奶酪中细菌群落的关系研 目、科、属和种水平上进行鉴定。 使用 FastTree [16] 软
究为侧重点,对样品中细菌多样性进行详细分析,希 件构建基于 OTU 代表性序列的系统发育进化树,随
望能够充实俄罗斯传统奶酪理论研究数据,为其中 后计算香农指数(Shannon鄄Wiener index)、发现物种
微生物的开发应用提供理论依据。 数(observed species)、超 1 ( chao1) 指数和辛普森
(Simpson)指数共 4 个 Alpha 多样性指标,分别对样
1摇 材料与方法 品菌群构成的丰度和多样性进行评价。 同时,采用

香农多样性指数(Shannon s diversity index) 和稀疏
,
1郾 1摇 实验材料
曲线( rarefaction curve) 评估每个样本测序的多样
6 份传统奶酪样品采自俄罗斯卡尔梅克共和
性,并判断当前测序量是否能够满足后续分析的需
国,具体信息见表 1。
要。 使用 UniFrac 距离进行加权(weighted) 和非加
表 1摇 样品信息
权(unweighted) 的主坐标分析,揭示各个样本之间
Tab. 1摇 Sampling information
菌群结构的差异 [17] 。
样品编号 采样地
R1 亚什库尔镇嘎西贡 2摇 结果与分析
R2 亚什库尔镇嘎西贡
R3 亚什库尔镇 2郾 1摇 细菌序列丰度和多样性
R4 亚什库尔镇
6 份奶酪样品的 454 焦磷酸测序序列信息和 琢
R5 伊科朝纳斯
多样性指数如表 2。
R6 亚什库尔镇
由表 2 可知,6 份奶酪样品共得到 89 393 条高
1郾 2摇 实验方法 质量细菌基因序列,每个样品平均序列为 14 899 条
以本研究团队采用 454 焦磷酸测序技术获得的 (序列数范围:13 485 ~ 17 261)。 根据 97% 的序列
6 份奶酪样品序列数据为分析对象,序列已上传至 相似度划分分类操作单元(OTU),共得到 369 条具
MG鄄RAST 数 据 库, 编 号 为 No. 4682839郾 3— 有代表性的细菌 OTU 序列。 结果显示,R6 号样品
4682844郾 3。 的 琢 多样性指数均高于其余 5 份样品,表明 R6 号
1郾 2郾 1摇 高质量序列的筛选 样品微生物多样性最高。 根据表 2 信息绘制样品稀
测序得到的原始数据确认引物所在位置,认为 疏曲线图(a) 和香农指数图(b) 分别用于分析样品
引物之间的区域为可变区,从原始序列中筛选可变 中微生物的丰度和多样性,结果如图 1。
区长度大于 300 bp 的序列,tag 按照样本鄄tag 编号筛 由图 1(a)可知,6 份奶酪样品的稀疏曲线均未
选,必须为首 7 位且不允许错配。 控制整条序列上 进入平台期,这表明随着测序量的增加,新的细菌种
质量大于 20 的碱基所占比例高于 93% 。 经过筛 系将被发现。 而图 1(b) 显示的 Shannon 曲线已经
选,可以认为提取出长度、质量、引物、tag 各方面均 饱和,这表明随着测序量的增加细菌多样性将不再
有效的高质量序列 [10 - 11] 。 改变,因此当前测序量可以满足后续分析的需要。