枣(Ziziphus jujuba Mill.)是鼠李科(Rhamna-ceae)枣属(Ziziphus)植物,起源于野生酸枣。因枣果数量庞大,在3 000多年前人们开始驯化栽培野生枣果,并形成一定规模的枣树栽培区,随后枣树逐渐被引入到中国周边国家[1-2]。红枣富含多种营养成分,如碳水化合物、蛋白质、维生素以及丰富的脂肪酸和包含8种人体必需氨基酸在内的氨基酸[2-3],不仅方便食用,还深受消费者的喜爱。但由于红枣鲜果采摘后的保质期仅有10～15 d,红枣加工产品是主要的售卖形式。

随着人们对食品营养健康的日益重视,一些红枣功能性产品的市场数量日益增多,例如红枣酵素、红枣酒、红枣醋等发酵食品[2]。Liu等[4]通过正交试验优化了酿酒活性干酵母发酵红枣汁的条件,制得的红枣酒清澈透明,具有新鲜红枣香气的同时口感香甜醇厚;Wang等[5]采用响应面试验优化枣醋的制备条件,当醋酸菌接种体积分数为15%、发酵温度为30.44 ℃、初始酒精含量为6.45%时,枣醋抗氧化能力较好,且香气柔和不刺激,果香突出。除了在工艺优化上提高发酵产品品质,发酵菌株对其也有较大影响。Zhang等[6]通过电子鼻和电子舌比较单一酿酒酵母发酵和酿酒酵母与乳杆菌混合发酵情况下产品的感官差异,发现添加混菌发酵后,醇香和果甜香有所增加;Zhao等[7]利用植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌发酵红枣汁,发现与单一乳酸菌发酵相比,两种乳酸菌发酵后的活菌数与抗氧化能力均有所提高,可见混菌发酵对于提高红枣汁风味品质有较好的前景。

研究发现,红枣作为微生物代谢发酵的优质底物,混菌发酵的代谢途径可分解枣中的糖苷类化合物生成更多的挥发性化合物,丰富红枣汁的香韵组成[7-9]。因此有关红枣发酵后的香气组成、风味形成原因的研究也正不断深入。Xia等[10]经过顶空固相微萃取(headspace solid phase micro-extraction,HS-SPME)结合气相色谱质谱-嗅闻技术(gas chromatography-mass spectrometry- olfactometry, GC-MS-O)检测红枣白兰地酒,最终确定得到如辛酸乙酯、月桂酸乙酯、2-十一酮等8种红枣酒中的关键香气成分,并在微生物代谢途径中发现一些甲酯转换为乙酯类物质,如2-甲基丁酸乙酯,可能带来果香和酒香。Cai等[11]通过电子舌与电子鼻对不同乳酸菌发酵的红枣汁在挥发性化合物上的差异,结果表明电子鼻中含硫化合物的传感器对发酵后的红枣汁不敏感,而对芳香化合物的响应高于发酵前,可见发酵后的风味有明显提升;同时在电子舌检测中增加了一定回味和丰富感,这表明乳酸菌在红枣底物中具有较好的适配性。同时这些研究为红枣发酵产品的风味优化提供理论依据,推动了混菌发酵红枣产品的开发创新。

在红枣发酵产品的研究中,将发酵制备工艺的优化与发酵后风味变化的分析相结合,具有一定的应用价值。为深入探究发酵红枣液的风味特点,本研究通过单因素及响应面试验优化植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)与巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)混合发酵红枣汁的制备工艺,并采用HS-SPME和溶剂辅助风味蒸发(solvent assisted flavor evaporation,SAFE)两种前处理方法进行GC-MS-O分析,期望对优化制备工艺下的红枣风味发酵液的香气特点进行全面的分析,最终确定红枣风味发酵液的关键香气成分,为后续发酵风味调控及混菌产香途径提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新疆若羌枣干(Ziziphus jujuba cv. Ruoqiang),购自新疆若羌生态健康枣园,使用前经过清洗和去核;2株植物乳杆菌(L. plantarum)分别购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC 编号1.12394,LP1)、中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC 编号21825,LP2),1株巴斯德毕赤酵母(P. pastoris)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC 编号2.4869,PP);3株菌株均已活化并装入含有甘油的冻存管中保藏,存放于-80 ℃冰箱保存。

MRS肉汤培养基、YPD培养基、琼脂粉,青岛海博生物科技有限公司;果胶酶(酶活力30 000 U/g)、纤维素酶(酶活力20 000 U/g),江苏奕农生物有限公司;二氯甲烷(AR级,≥99.5%)、氯化钠,中国医药集团(上海)有限公司;邻二氯苯溶液(1×10-6 g/g质量比的丙酮稀释液),上海玻尔化学试剂有限公司;C7～C30正构烷烃(AR级,≥99.5%),美国Supelco公司。

1.2 仪器与设备

HWS-24型电热恒温水浴锅,上海一恒科学仪器有限公司;FiveEasy20型台式pH计,瑞士Mettler Toledo公司;8860-5977B型气相色谱质谱联用仪,HP-INNOWAX型极性石英毛细管柱(60 m×0.25 mm,0.25 μm),美国Agilent公司;ODP-4型嗅闻仪,德国Gerstel公司;TGL-16M型高速冷冻离心机,上海卢湘仪离心机仪器有限公司;MQD-S2NR型振荡培养箱,上海旻泉仪器有限公司;PAL-1型手持糖度计,日本ATAGO(爱拓)公司;50/30 μm DVB/CAR/PDMS型固相微萃取头,美国Supelco公司;SAFE60型溶剂辅助风味蒸发装置,北京康百特科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌株活化

将使用甘油保藏的LP1、LP2与PP以8% 接种体积分数分别涂布于加有碳酸钙的MRS肉汤培养基和YPD固体培养基上,一定温度下培养48 h后,挑取单菌落划线,并接种于新的培养基中培养48 h,连续活化2次。在划线平板上取单菌落转接于对应的液体培养基中,摇床30 ℃或37 ℃培养18 h,用无菌水重悬菌体,4 ℃贮存备用(活菌数≥1×107 CFU/mL)。

1.3.2 红枣风味发酵液的制备

红枣打浆后进行酶解,然后调节pH值和白利度,灭酶灭菌,接种发酵后灭菌。具体过程是将去核的红枣干按一定比例加热水[m(红枣干)∶V(水)=1g∶6mL]浸泡20 min后打浆,得到红枣汁。待枣汁恢复至室温后加入适量的果胶酶与纤维素酶(果胶酶与纤维素酶的质量比为2∶1,混菌接种体积分数0.2%)进行酶解,而后调节酶解液的pH值和可溶性固形物含量并分装至锥形瓶,在90 ℃下进行巴氏灭菌20 min,待冷却至室温后将活化好的菌种用无菌水稀释至1×107 CFU/mL,并按体积百分比接种至红枣酶解液中,置于振荡培养箱进行动态发酵,发酵结束后取出进行灭菌得到红枣风味发酵液。

1.3.3 理化指标的测定和喜好度评价

1)可溶性固形物含量的测定。用手持糖度计进行测定,结果经3次测定值取平均值。

2)pH值的测定。用pH计进行直接测定,测定前经过pH值为4.01和6.86的校准液进行校准。

3)喜爱度评价。由40人(17名男生和23名女生,年龄20～35岁)组成评价小组,成员在打分前未经培训。对红枣风味发酵液的外观、口感、香气进行评估,并给出总体喜爱度评分,满分为10分,喜爱程度按照分值依次递增:0～1分表示极度不喜欢;4～5分表示中等程度;6～8分表示喜欢;9～10分表示极度喜欢。

喜爱度打分评定标准见表1,评分一列将喜爱程度进行划分:0～1.5分表示喜爱程度中等偏下,1.6～3分表示喜爱程度中等,3.1～4分表示极度喜爱;由于“外观”项区分较不明显,因此给出喜爱程度中等和极度喜爱2个等级。

1.3.4 制备工艺优化

1.3.4.1 单因素实验

固定混合发酵剂体积配比1∶1∶1,选择混菌接种体积分数(1%、2%、3%、4%、5%)、接种前pH值(4.55、4.65、4.75、4.85、4.95)、发酵时间(16、17、18、19、20 h)、发酵温度(32、33、34、35、36 ℃)、发酵转速(110、120、130、140、150 r/min)5个因素进行单因素实验,研究各因素对发酵液pH值大小和喜爱度感官打分的影响。

1.3.4.2 响应面试验

在单因素实验的基础上,选择(A)混菌接种体积分数、(B)发酵时间以及(C)发酵温度3个因素为自变量,以喜爱度打分为因变量,进行三因素三水平响应面试验,实验因素及水平设计见表2。

1.3.5 感官评价

通过酒精阈值测试,从感官评价小组中挑选出5名男生和5名女生做进一步的感官培训。培训参考ISO 8589:2007,培训内容主要为熟悉红枣干果及红枣风味发酵液的香气,并给出红枣风味发酵液的香气描述词,经集体讨论和筛选整理,最终得到的7种感官描述词及其对应的参考物,见表3。小组成员按照0～9分强度法进行打分,其中0表示感受非常弱,5表示感受中等,9表示感受非常强[12]。

1.3.6 关键香气成分的分析

1.3.6.1 挥发性化合物的前处理

将优化制备条件下制得的红枣风味发酵液和发酵前的酶解液进行85 ℃的灭菌灭酶处理,装入顶空样品瓶进行HS-SPME后,完成GC-MS的分离检测。

HS-SPME条件:参考Xia等[10]的方法,平衡萃取温度60 ℃,1.0 g氯化钠,4.5 μL邻二氯苯溶液,萃取时间40 min。

SAFE条件:称取发酵液150 mL与二氯甲烷溶剂以体积比为1∶1混合,同时加入120 μL邻二氯苯溶液内标物,常温下搅拌萃取2.5 h得到水相和有机相的混合液,并通过抽滤将枣皮和液相分离,得到待测液。循环水40 ℃,1×10-5 Pa条件下经过SAFE装置从二氯甲烷有机相中分离得到带有挥发性成分的馏出物,待馏出物恢复至室温后,加入无水硫酸钠除去多余水分,并经过旋转蒸发仪的蒸发浓缩及氮气的吹扫浓缩得到约1 mL的浓缩液,于-20 ℃冰箱中冷冻保存。

1.3.6.2 挥发性化合物的GC-MS检测条件

GC条件:进样口温度250 ℃,采用程序升温,柱初温40 ℃保持2 min,以3 ℃/min升至85 ℃,再以5 ℃/min升至230 ℃保持10 min;载气为高纯氦气,载气流量12 mL/min,分流进样模式5∶1,总流量10 mL/min。 HS-SPME萃取条件下在GC进样口解析10 min,SAFE萃取条件下GC进样量1 μL。

MS分析条件:电子轰击离子源;离子源温度230 ℃,四级杆温度150 ℃,电离能源70 eV,扫描范围m/z 50～550 u,溶剂延迟6.5 min。

1.3.6.3 挥发性化合物的定性和定量分析方法

定性分析。挥发性化合物的定性主要通过MS质谱库、保留指数(retention index,RI)和嗅闻完成,将化合物质谱图与NIST 20标准谱库对比,确认得到每个出峰时间内匹配度前三的化合物,并在相同的色谱条件下测定C7～C30正构烷烃标准品得到标准品的保留时间(retention time,RT),计算挥发性化合物保留指数(RI),计算方法见式(1)。

(1)

式(1)中,n表示某一正构烷烃的碳原子数;x表示待测化合物;RT表示出峰时间;其中RTx在RTn与RTn+1之间。

定量分析。采用内标法对待测样品的挥发性化合物进行半定量分析,以质量浓度为100 mg/mL的邻二氯苯溶液作为内标物。

通过该内标物的添加量和峰面积对待测化合物进行半定量计算,计算方法见式(2)。

(2)

式(2)中,s表示内标化合物邻二氯苯溶液;x表示待测化合物;ρ和V分别代表内标物的质量浓度(mg/mL)和体积(μL);A代表峰面积;m代表称取待测样品的质量,g。

1.3.6.4 关键香气成分的GC-O和OAV检测

研究使用GC-O和OAV方法确定红枣风味发酵液的关键香气成分。

GC-O分析条件:升温程序同1.3.6.2节,传输线温度250 ℃。为确保实验结果的一致性及准确性,GC-O嗅闻由3名对香原料熟悉、经过专业培训的感官嗅闻人员组成,采用两种方法进行嗅闻定性:1)香气强度法,香气强度按照5分制打分(0分表示嗅闻不到,1分表示香气微弱,2分表示香气中等,3分表示香气较强,4分表示香气强烈)。嗅闻人员在打分的同时记下香气描述,最终将2位及以上嗅闻人员所闻到的香气进行整理记录;2)香气萃取物稀释分析(AEDA)法[13],根据香气强度法对两种提取方法下的待测样品进行比对,选择提取方法效果较好的一种方法进行进一步的AEDA。HS-SPME法的香气成分是通过成倍减少样品体积完成稀释[14],初始样品量5 mL(FD=1);SAFE法的香气成分是通过二氯甲烷成倍稀释完成,初始样品量1 mL,二氯甲烷1 mL(FD=1),稀释倍数均为2n,嗅闻人员采用与样品分析相同的GC程序进行嗅闻,直至在同一出峰时间嗅闻不到该物质为止,记录最终的稀释倍数,即FD因子,FD=2n。

香气活力值(OAV)计算方法见式(3)。

(3)

式(3)中,Wx表示某一待测化合物的质量浓度,μg/mL;Tx表示某一待测化合物通过文献[15]查到的气味阈值,mg/mL。

1.4 数据处理

采用Design-Expert 10.0软件中的Box-Behnken模式进行响应面试验设计;采用IBM SPSS 26.0进行ANOVA分析;采用Excel 2011对定量的挥发性化合物进行计算汇总;相关性分析使用The Unscrambler X10.4;折线图、柱状图、雷达图、气泡图采用Origin 2024绘制。

2 结果与分析

2.1 制备工艺单因素实验结果分析

红枣风味发酵液制备的单因素实验结果见图1。

2.1.1 混菌接种体积分数的影响

当接种前pH值、发酵时间、发酵温度、发酵转速等条件相同时,发酵液的喜爱度评价随着混菌接种体积分数的提高而不断下降,且混菌接种体积分数高于3%时,喜爱度评分开始迅速下降,见图1(a);当混菌接种体积分数为1%时发酵后的pH值最高,为3.8,与混菌接种体积分数2%～ 4%的pH值有显著差异,由于pH值的降低相当于微生物代谢的产氢量增多[16],因此较低的混菌接种体积分数1%可能不适合微生物的代谢生长,综合喜爱度评分和混菌接种体积分数在2%～4%时的pH值相近,在后续的响应面试验中选择混菌接种体积分数2.5%、3%和3.5%来进一步研究。

2.1.2 接种前pH值的影响

接种前pH值的提高使得发酵后的pH值和喜爱度打分呈现先增后减的趋势,当接种前红枣汁的pH值调节在4.65～4.85时,混菌发酵剂效果较好,且喜爱度评分由1.5迅速上升至3.9,见图1(b)。随后缓慢下降,可见接种前pH值的过低和过高都使得发酵液的感官效果不好,因此最佳接种前pH值确定为4.75。

2.1.3 发酵时间的影响

随着发酵时间的延长,发酵后的pH值逐渐降低,但喜爱度打分仅在发酵18 h时最高,见图1(c)。由此可见发酵时间的长短对发酵效果的影响较大,在后续的响应面试验中选择发酵时间17.5 h、18 h和18.5 h来进一步研究其对发酵液整体喜爱度的影响。

2.1.4 发酵温度的影响

由于混菌发酵剂中乳酸杆菌的最适温度为37 ℃,而酵母菌最适温度在30 ℃,随着发酵温度不断接近37 ℃,发酵后的pH值变化显著,见图1(d)。但感官喜爱度显示发酵温度在32～34 ℃时喜爱度上升缓慢,随后在35 ℃迅速下降,因此选择33.5、34、34.5 ℃作为响应面试验中的3个水平。

2.1.5 发酵转速的影响

发酵时间相同的情况下,动态发酵的转速对微生物代谢效率的影响较大,见图1(e)。pH值有显著变化,并且随着转速提高至130 r/min及以上,喜爱度评分下降快速,而在150 r/min时评分有所回升,这可能是因为有一部分感官成员喜欢酵母菌产乙醇后带来的酒香,因此最佳发酵转速确定为120 r/min。

2.2 制备工艺的响应面试验结果分析

根据发酵制备工艺的单因素实验结果可知,接种前不同pH值与发酵时的不同转速条件对发酵液的最终pH值和喜爱度评价在显著性差异上有类似的趋势,影响不如其他3个因素,因此不选择对其进一步优化,选择(A)混菌接种体积分数、(B)发酵时间和(C)发酵温度作为自变量的3个因素,以喜爱度感官评分作为因变量,响应面试验结果见表4,方差分析结果见表5。三因素与红枣风味发酵液喜爱度感官评分的回归模拟方程为:y=7.92-0.34A+0.92B-1.69C-0.45AB-0.34AC+0.97BC-1.34A2-1.26B2-1.48C2。

由表5的方差分析结果可以看出,喜爱度感官评分的回归模拟方程的误差P值小于0.001,表示此模型极显著,同时模型失拟度为0.130 2(P>0.05),表明感官评分的回归模型与数据拟合的误差较小,决定系数R2=0.986 5接近1,表示该模型拟合情况良好,能够反映各因素对喜爱度感官评分的影响。此外,结合F值可知,3个因素对喜爱度感官评分的影响由大到小分别为C(发酵温度)、B(发酵时间)、A(混菌接种体积分数)。

各因素之间的交互作用可通过等高线图和响应面更直观地看出,见图2。等高线形状越圆,则两因素之间交互作用最弱,而当等高线形状为椭圆时,两因素的交互作用越强[17]。发酵时间与发酵温度间的交互作用最显著,其次是混菌接种体积分数与发酵时间的交互作用,混菌接种体积分数与发酵温度间的交互作用最弱,这一结果与回归模型中的显著性分析类似。

利用二次回归模型的预测,得到各因素的最优条件为:混菌接种体积分数2.98%、发酵时间18.15 h、发酵温度33.9 ℃,此时预测的喜爱度感官评分达到最大理论值8.29分。考虑到实际操作要求,选择最佳发酵条件为混菌接种体积分数3.0%、发酵时间18.17 h(18 h 10 min)、发酵温度33.9 ℃进行发酵,并进行3次平行验证,得综合感官评分为8.27分,与回归模型的理论值接近。因此,该模型能够较好地优化红枣汁的发酵制备工艺条件,说明响应面优化的结果具有可行性。

2.3 红枣风味发酵液的定量描述分析法结果

为防止红枣风味发酵液停止发酵后变质,采用巴氏灭菌和低温离心两种方式进行灭菌,并让感官评价小组成员对其进行打分,结果见图3。由图3可知,两种灭菌方式下甜润枣香占主导香气,其次是酸香,酒香、果香,除蜜甜花香在离心后表现出较大的损失,而类似菌泥的异味在离心后体现较不明显外,整体香气组成轮廓较相似。低温离心虽然可以快速除去发酵所用的菌株,并使得红枣风味发酵液变得澄清透明,但容易引起风味变化。由图3可知,离心不仅对蜜甜花香的影响较显著,且酸香增大,果香弱于巴氏灭菌。Li等[18]的研究中表示,一些萜烯类和醇类化合物在离心后存在于果肉和浆液中而不是在上层清液中,Kuo等[19]认为挥发性较好、极性较弱的酯类物质更易在离心力的作用下挥发损失,这使得离心后的整体香气弱于巴氏灭菌。不仅如此,榨汁打浆得到的红枣汁中存在糖苷类物质,高温加热可促使单萜类醇类物质的生成。这解释了巴氏灭菌后果香和甜香感官评分较高的原因,而低温离心容易使发酵液中的枣皮与菌泥一同丢弃,减少了发酵液中红枣本身的特征香气,因此,选择巴氏灭菌的红枣风味发酵液进行后续的挥发性化合物分析。

2.4 红枣风味发酵液的挥发性化合物分析结果

2.4.1 基于2种提取方法的GC-MS分离鉴定结果

采用HS-SPME和SAFE两种方法对发酵液的挥发性化合物进行萃取并结合GC-MS分析,共检测得挥发性化合物48种(不包括对照组,对照组为发酵前的红枣汁),含有酸类化合物16种、酯类物质10种、醇类物质4种、醛类物质3种、酮类物质6种、苯及其衍生物5种、内酯类2种和其他类2种(见表6)。2种萃取方式检测到的挥发性化合物含量及其种类个数鉴定结果见图4。

由图4可知,其中酸类化合物在2种提取条件下检测得最多,分别是15种和12种,这是由于红枣本身就富含多种酸类化合物和有机酸,例如乙酸、C4～C10的直链酸类、油酸、棕榈油酸等[20-21],并且由于红枣干中碳水化合物含量以及还原糖含量均高于70%,为乳酸菌的代谢生产提供丰富底物[2,22],经过微生物的发酵代谢后可生成更多的酸类物质,使得酸香在发酵后突显出来。

酯类物质主要具有果香和甜香,在发酵的过程中,酵母菌代谢产生的乙醇与乳酸菌代谢产生的酸类物质结合形成乙酯类化合物[10],结合表6可知,SPME比SAFE多了碳原子数较小的酯类化合物:4-甲基戊酸甲酯(D1)、癸酸甲酯(D4)以及十四酸乙酯(D8),这3种化合物分别带有果香、酒香、花香香气,而和SAFE共有的月桂酸甲酯(D5)、肉豆蔻酸甲酯(D7)和棕榈酸甲酯(D9)香气特点多为脂蜡香气和甜润香气,是红枣中原有的香气化合物[23]。

醇类化合物个数较少,其中正戊醇(A1)具有发酵酒香,而苯甲醇(A2)具有温和花香,苯乙醇(A3)带有偏蜜甜的玫瑰花香,它们被认为是酵母菌的代谢产物,其中A2和A3通过苯丙氨酸的分解得到[24]。在红枣果酒的发酵风味研究中,Zhao等[25]通过不同酿酒酵母对红枣汁进行发酵,发现尽管不同酵母菌产生的香气化合物种类也不同,但酵母产生的酯类化合物与生成的低级醇特别是发酵酸为主的戊醇含量之比对红枣酒的整体风味具有重要影响,由此可见醇类化合物在发酵液香气中的作用。

醛类化合物在脱氢酶的作用下由C16～C22不饱和脂肪酸氧化或支链氨基酸降解得到[26],红枣风味发酵液中主要检测到了苯甲醛(B2)和苯乙醛(B3),B2的主要香气特征为苦杏仁,但在低浓度下带有甜香和淡花香,B3被认为是风信子的花香,同时具有叶青香气。酮类化合物的含量整体占比较小,多为甜香、果香和花香,其中察觉阈值(0.000 02 mg/mL)最低的是β-大马士酮(E2),具有浓郁的玫瑰甜香,尽管其含量略低于贡献果香的对甲氧基苯基丙酮(E7),但由于低阈值,其香气活力值显著高于其他挥发性化合物,对醛类、醇类化合物的香气具有协同增效的作用。其他类化合物是2-乙基-6-甲基吡嗪(H2),这是红枣干燥后带有的烤香类物质[21],与红枣油润香气共同存在于红枣风味发酵液中。由表6中对照组的香气成分组成可知,除一些脂肪酸甲酯类化合物含量减少外,红枣汁中原有的大部分挥发性化合物含量在发酵后有所增加,这与酵母菌与醋酸菌混合发酵红枣醋类似,发酵后增加了酸香与果香类化合物,丰富了红枣汁的果甜香和酸香[27],此外,在本研究中,乳酸菌与酵母菌的混合发酵还使得红枣风味发酵液的整体香气增加了花香和酒香,这些香韵特点为后续关键香气成分的确定提供依据。

为研究2种萃取方式与挥发性化合物的相关性,通过主成分分析对2种方法得到的挥发性化合物含量数据进行降维处理[28],结果见图5。由图5(a)可知,PCA载荷图的第一和第二主成分的总贡献率大于95%,表明这2个主成分能解释SPME和SAFE得到的大部分挥发性化合物的含量差异,由图5(b)和图5(c)可知,除植酮(E6)是红枣特有的具有脂蜡香、青甜香物质外,SPME对酮类、醇类、酯类化合物的富集效果较好,而SAFE对酸类和苯及其衍生物类化合物的萃取效果较好,这一分类结果与表6结果类似,SPME中几乎没有检测到带有苯环类的化合物,SAFE没有检测到醛酮类化合物,由此可见,不同提取方式对挥发性化合物的萃取和分离鉴定有着较大的影响。以往的研究认为,SPME易于高沸点挥发物的保留(醛类等),而SAFE处理过程中考虑到提取溶剂二氯甲烷的沸点,一些低于二氯甲烷沸点的挥发性化合物会在旋转蒸发时挥发损失掉大部分,并且通过SAFE的长时间萃取,最终得到的挥发性化合物含量及种类会大于SPME方式,但在香气类型上SPME要丰富得多[12]。通过查找挥发性化合物的香气描述词发现,尽管SAFE得到的化合物种类更多样化,但大部分香气主要偏向于类似苯酚的医药气味或温和芳香香气,对于某一香韵香气特征并未突出或增加,因此,后续的研究主要侧重于SPME萃取方式。

2.4.2 GC-O方法确定的关键香气化合物

尽管OAV值大小可反映待测样品中某一挥发性化合物对样品整体香气的贡献值大小,OAV数值越大表示香气贡献度越高,但该指标也存在一些局限性,需要感官嗅闻做进一步的确认[29]。通过香气强度法对两种提取方式下的发酵液进行GC-O嗅闻,结果见表7。通过嗅闻,共检测得到30种挥发性化合物,其中SPME嗅闻到17种,SAFE嗅闻到23种,但SAFE方式下感受到11种酸类化合物,占比近一半,并且SAFE处理过程中经过抽滤和旋转蒸发,一些花香类化合物和枣香特征物质香气强度较弱或未能感受到,此外,表7中嗅闻感受到的香气与相关文献查找的香气描述有差异,可能是在嗅闻描述中感受到的香气成分会与一些峰面积较小的其他化合物重叠,后续还需要调整检测方法进行进一步的分离鉴定。

表8汇总了两种提取方法共同嗅闻到的10种物质,发现这些化合物的香韵特点与定量描述法中的描述词相近:酒香(戊醇)、酸香(己酸、庚酸)、花香(苯乙醇),因此可以初步确定红枣风味发酵液中的关键香气化合物和关键香韵。

基于表7和表8发现,SPME更适合于分析巴氏灭菌下的红枣风味发酵液中的挥发性化合物,故选择不断减少顶空瓶中的样品量进一步进行稀释嗅闻。

以嗅闻到的挥发性化合物名称为x轴,稀释因子的对数为y轴,绘制气泡图,见图6。气泡越大的表示稀释倍数越大,其中β-大马士酮(FD=64)、苯乙醇(FD=32)、苯乙醛(FD=16)是红枣风味发酵液中花香韵的代表性物质,其次FD值较高的挥发性化合物是具有果甜香的十四酸乙酯(FD=8)、特征枣香物质月桂酸甲酯(FD=8)以及酸香较明显的己酸(FD=8),其余FD值较小的挥发性化合物使得红枣风味发酵液的整体香气更加丰富、协调,例如果香香韵的癸酸甲酯、具有酒香挥发性香气感受的戊醇、木香特征的雪松醇,因此,β-大马士酮、苯乙醇、苯乙醛、十四酸乙酯、月桂酸甲酯、戊醇、己酸、雪松醇、癸酸甲酯是红枣风味发酵液中的关键香气成分。

在混菌发酵过程中,微生物的代谢和营养成分的降解使得红枣汁的香气组成发生改变并增加了许多新的挥发性化合物,例如,乳酸菌与酵母菌的代谢将红枣中的糖类降解为乳酸、乙醇、乙酸等有机酸和醇类[28],这些物质进一步与发酵前红枣汁中的其他化合物反应,生成了一系列新的挥发性化合物,正是这些新生成的香气成分赋予红枣风味发酵液更丰富的香韵组成。例如具有玫瑰特征花香的β-大马士酮,其在以往的研究中被指出是通过类胡萝卜素的降解产生的含有十三碳的降异戊二烯衍生物[30],带有发酵特征香气的戊醇是氨基酸底物在微生物作用下降解得到的天然产物[31],而十四酸乙酯、癸酸甲酯这些具有果甜香的酯类化合物则是通过葡萄糖在酵母菌的作用下生成乙醇后又与红枣汁本身含有的有机酸进行生物合成产生的[32-33]。此外,由于雪松醇的阈值较低,感官小组成员能够感觉到它的存在,因此也被认为是红枣风味发酵液的关键香气成分之一。

3 结 论

经过乳酸菌和酵母菌的混合发酵,开发了一种区别于红枣酒的红枣风味发酵液,并优化动态发酵的制备工艺条件:发酵转速120 r/min、接种前pH值4.75、混菌接种体积分数3.0%、发酵时间18 h 10 min、发酵温度33.9 ℃,该红枣风味发酵液的酒香较不明显,酸香与红枣原本的甜香混合较好,同时形成了蜜甜花香和熏甜木香,丰富了红枣汁的香气。通过不同前处理方式萃取发酵液中的挥发性化合物并经过GC-MS分析,共得到酸类化合物16种、酯类物质10种、醇类物质4种、醛类物质3种、酮类物质6种、苯及其衍生物5种、内酯类2种和其他类2种,结合PCA和香气强度法嗅闻发现,HS-SPME更适合于提取红枣风味发酵液中的挥发性化合物,进一步地,感官评价和稀释嗅闻最终确定了红枣风味发酵液的关键香气化合物为β-大马士酮、苯乙醇、苯乙醛、十四酸乙酯、月桂酸甲酯、戊醇、己酸、雪松醇、癸酸甲酯。

红枣因保质期较短不易存储,为延长其保质期和提高产品附加值,红枣加工产品特别是发酵产品具有广泛的应用前景,通过单因素与响应面试验优化了红枣发酵制备工艺,提高了混菌发酵红枣汁的品质和营养特性。研究结果旨在为红枣深加工产品的创新风味挖掘提供参考和理论依据。在未来的红枣加工产业中可参照本研究中的关键香气成分含量进行发酵放大生产,为丰富红枣发酵产品风味、助力红枣产业的整体升级提供理论支撑。

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Preparation and Key Aroma Components Analysis of Jujube Flavor Fermented Juice

CAI Weitong1, WU Wenhui2, WANG Xiaoyu2, FU Xia2, SUN Wei2, YAO Lingyun1, SUN Min1, WANG Huatian1, YU Chuang1, FENG Tao1,*

(1.School of Perfume and Aroma Technology, Shanghai Institute of Technology, Shanghai 201418, China; 2.Hunan Wuzizui Industrial Group Co., Ltd., Xiangtan 411100, China)

Abstract： Jujube is rich in nutrition, and there are numerous jujube flavored processed foods made from dried jujube, among which fermented products have attracted much attention. To study the flavor characteristics of co-fermented jujube juice, a mixed culture fermentation agent composed of Lactobacillus plantarum and Pichia pastoris was constructed. The preparation process of fermented jujube flavor juice was optimized through single factor and response surface design experiments. The two pre-treatment methods, headspace solid phase micro-extraction (HS-SPME) and solvent-assisted flavor evaporation (SAFE), were used for gas chromatography-mass spectrometry olfactometry (GC-MS-O) and aroma extraction dilution analysis (AEDA) to identify the key aroma components of fermented jujube flavor juice under the optimized process. The results showed that the optimized parameters for fermented jujube flavor juice preparation process were inoculation amount of 3.0%, pre-inoculation pH 4.75, fermentation time 18.17 h (18 hours and 10 minutes), fermentation temperature 33.9 ℃, and fermentation rotation speed 120 r/min, with the highest sensory score 8.27. Through GC-MS analysis, a total of 48 volatile components were detected, mainly including 12 acid compounds and 10 ester compounds. GC-O analysis showed that HS-SPME had a good extraction and enrichment effect on the aroma components of fermented jujube flavor juice. Finally, through AEDA, β-damascenone, phenylethyl alcohol, phenylacetaldehyde, ethyl tetradecanoate, methyl dodecanate, pentanol, hexanoic acid, cedrol, and methyl decanoate were identified as the key aroma components in fermented jujube flavor juice.

Keywords： jujube; fermentation; solvent-assisted flavor evaporation; key aroma components; AEDA

doi：10.12301/spxb202400536

文章编号：2095-6002(2026)03-0195-17

引用格式：蔡尉彤,吴文辉,王孝余,等.红枣风味发酵液的制备及其关键香气成分分析[J]. 食品科学技术学报,2026,44(3):195-211.

CAI Weitong, WU Wenhui, WANG Xiaoyu, et al. Preparation and key aroma components analysis of jujube flavor fermented juice[J]. Journal of Food Science and Technology, 2026,44(3):195-211.

中图分类号： TS255.44

文献标志码： A

收稿日期： 2024-11-07

基金项目： 上海应用技术大学校企联合项目(27220H230088-A06)。

Foundation: Shanghai Institute of Technology and Enterprise Joint Project (27220H230088-A06).

第一作者： 蔡尉彤,女,硕士研究生,研究方向为食品风味分析。

*通信作者： 冯 涛,男,教授,博士,主要从事食品风味化学方面的研究。

(责任编辑：李 宁)