双歧杆菌作为革兰氏阳性且严格厌氧的细菌属,构成了人体内不可或缺的有益微生物群落,具有改善胃肠道环境、提升营养物质吸收速率、降低胆固醇浓度以及强化免疫系统等功能[1]。近年来,双歧杆菌被广泛应用于菌粉制剂、发酵乳和冰淇淋等产品中,其中冰淇淋作为低温储存的乳制品,是良好的益生菌载体[2]。然而由于双歧杆菌对氧气、温度及pH值具有特殊的敏感特性,极易受到生产加工、储藏过程中多种胁迫环境的影响,导致活性大幅降低,从而限制了双歧杆菌在宿主体内益生功能的发挥[3]。目前,微胶囊化、添加冷冻保护剂和基因改造是保护益生菌活力的有效技术途径,但成本高、操作复杂、稳定性差、安全性低等缺点阻碍了益生菌食品的产业化应用[4]。鉴于此,亟须寻找提高双歧杆菌自身抗逆性的新策略以有效提高其益生菌存活率。

生物被膜是微生物附着于有生命或无生命物体表面,通过分泌复杂的胞外聚合物基质(extracellular polymeric substances,EPS),包含胞外多糖、蛋白质、eDNA等组分,形成的三维网状聚集体[5]。生物被膜以菌株的自我保护和代谢调节为基础,从根本上保护菌株免受恶劣环境影响。Grossova等[6]研究发现,益生菌生物被膜相较于致病菌生物被膜具有更强的抗逆能力。由于生物被膜可增强细胞对细胞膜冷冻损伤的修复能力,副干酪乳杆菌DTA83[7]、鼠李糖乳杆菌GG[8]、植物乳杆菌LPI-1[9]等菌株形成生物膜后抗冷冻胁迫能力显著提高。因此,借助益生菌生物被膜的构建提高菌株活性在益生菌冰淇淋工业化应用中具有广阔的前景。

生物被膜形成的数量和质量是其发挥潜在作用的关键。目前已有研究多数采用孔板、玻璃板载体进行静置培养,无法为益生菌定植提供足够的表面积并且难以形成高密度生物被膜。载体表面图案化是提高细菌黏附效率的重要因素。纤维质农副产品表面粗糙多孔,不仅给菌株提供高比表面积的成膜界面,同时作为益生元能够提供更好的产品附加值。Rajasekharan等[10]研究发现,枯草芽孢杆菌在鹰嘴豆奶的淀粉纤维上形成生物膜后具有更高的存活率和耐受性。Heumann等[11]研究发现,副干酪乳杆菌ATCC 334在果胶酸钙微珠上形成致密生物被膜,表现出对冷冻干燥胁迫的高抗性。此外,振荡培养方式可通过剪切应力主动调控菌株结构、黏附定植时间和营养供应,形成结构更加成熟和稳定的生物被膜,从而弥补静置培养条件下生物被膜与载体黏附力弱、易分散等缺陷。然而,现有研究多局限于静置培养体系且载体筛选缺乏针对性,难以快速制备高密度、高抗逆性的被膜态益生菌,针对动物双歧杆菌 Gr24 以纤维质农副产品为载体、采用振荡培养方式制备生物被膜并应用于益生菌冰淇淋的研究鲜有报道。

前期研究从中国新疆和田拉依苏长寿村健康百岁老人志愿者的粪便中分离得到了一株具有较好生物被膜形成能力和益生特性的动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis) Gr24。本研究拟通过分析5种不同载体上动物双歧杆菌Gr24生物被膜的成膜率、组成和结构,筛选最佳载体以确定其生物被膜振荡培养条件,解决动物双歧杆菌Gr24活性低、应用效果差的问题。通过评估被膜态菌株在优化振荡培养条件下的抗冷冻胁迫能力,确定其在益生菌冰淇淋中应用的潜力,并通过测定益生菌冰淇淋的营养成分、理化性质、储存过程中益生菌数变化、感官品质和储存后益生特性评估振荡培养条件下被膜态动物双歧杆菌应用的可行性,旨在为被膜态益生菌大规模工业化生产提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp. lactis) Gr24(CGMCC1.2891)分离自新疆和田拉依苏长寿村健康百岁老人志愿者的粪便。MRS肉汤培养基、刃天青、半胱氨酸盐酸盐、NaCl、胃蛋白酶(1∶10 000,酶活≥250 U/mg)、胰蛋白酶(1∶250,酶活≥250 U/mg),北京索莱宝科技有限公司;浓H2SO4、HCl、苯酚、无水乙醇,国药集团化学试剂有限公司;豌豆壳、麸皮、大豆膳食纤维、甲壳素、阳离子淀粉,北京鸿润宝顺科技有限公司。奶油、脱脂奶粉、蔗糖、复合稳定剂(明胶、硬脂酸甘油酯、瓜尔胶质量比为2∶3∶5),深圳海川食品科技有限公司;DNA基因提取试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒,北京天根生化科技有限公司;DPPH自由基清除能力检测试剂盒、T-AOC总抗氧化能力测试盒,南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

LD224型台式电子天平,上海普利赛斯有限公司;MT-500型 pH计,上海雷兹科技有限公司;HVE-50型高压灭菌锅,日本Hailama公司;DG250型厌氧工作站,英国Don Whitley Scientific公司;SW- CJ-1FD型超净工作台,武汉华威科创有限公司;Zetasizer Nano ZS型粒度、Zeta电位分析仪,英国马尔文帕纳客公司;SU8220型扫描电镜,日本日立高新技术公司;OLS5100型激光共聚焦显微镜,日本Olympus Corporation公司;CLARIO-Star型全波长酶标仪,德国BMG公司;BF-10型小型高速粉碎机,河北北辰科技有限公司;DBXS-A5型组合式冰淇淋机,天津市特斯达食品机械科技有限公司;Nano-Genizer20k 型高压均质机,美国Genizer公司;LVDV-S型旋转黏度计,美国Brookfield公司;TMS-PILOT型质构仪,北京盈盛恒泰科技有限责任公司;Ci7x00型色差仪,日本柯尼卡美能达公司。

1.3 实验方法

1.3.1 被膜态双歧杆菌Gr24的振荡培养

1.3.1.1 振荡培养条件的优化

动物双歧杆菌Gr24接种(体积分数2%)到改良的MRS培养基(MRS中添加0.5 g/L L-半胱氨酸盐酸盐、1 g/L刃天青)中,37 ℃厌氧培养18 h,活化3代至菌液OD600为0.9～1.0,处于对数生长期。

本研究中动物双歧杆菌 Gr24 的培养时间、接菌量、载体添加量、振荡速率等核心条件,均已通过前期研究优化确定为最优值。振荡培养组(动态组)以豌豆壳、麸皮、大豆膳食纤维、甲壳素、阳离子淀粉为载体,首先将载体涡旋1 min,乙醇超声10 min,再涡旋1 min,蒸馏水中超声10 min进行初步清洗,并将2 g/100 mL最佳载体添加到改良MRS培养基中,高温高压灭菌(121 ℃,15 min),再将对数期的动物双歧杆菌Gr24接种到培养基中,于37 ℃和120 r/min转速下厌氧培养0～48 h。静置培养组(静态组)是将对数期的动物双歧杆菌Gr24在添加了2 g/100 mL载体的改良MRS培养基中静置厌氧培养0～48 h。浮游态培养组(浮游组)是将对数期的动物双歧杆菌Gr24在改良MRS培养基中于37 ℃和120 r/min转速下厌氧培养 0～48 h。其中静态组和浮游组是对照组。载体组是将2 g/100 mL最佳载体添加到改良MRS培养基中,高温高压灭菌(121 ℃,15 min),于37 ℃和120 r/min 转速下厌氧培养0～48 h。通过测定pH值、载体粒径变化、胞外聚合物(EPS)含量、成膜率、生物被膜含量和微观结构以筛选最佳载体,确定最佳振荡培养条件。

1.3.1.2 pH值和载体粒径的测定

1)pH值。动态组pH值采用pH计进行检测。

2)粒径。取动态组1 mL溶液并稀释到1 000倍,采用粒径分析仪进行粒径的检测。分别测定0、12、24、36、48 h浮游组、载体组和动态组的粒径。

1.3.1.3 益生菌数和成膜率的测定

采用Ushakova等[12]的方法测量益生菌数、成膜率。将动态组样品分为2份,一份在常温下静置2 h使其自然沉降,吸取上清液进行梯度稀释至10-6、10-7、10-8,并进行菌落计数,结果记为体系中浮游益生菌数(CFU/mL);另一份涡旋振荡(2 500 r/min)3 min,再进行间断超声处理(0.5 W/cm2, 40 kHz),30 s超声后间隔5 s,重复5次,重悬5 min后进行梯度稀释,并进行菌落计数,结果记为体系中总益生菌数(CFU/mL)。成膜率计算见式(1)。

成膜率=(总益生菌数-浮游益生菌数)/总益生菌数× 100% 。

(1)

1.3.1.4 生物被膜组成的测定

生物被膜组分主要包括胞外多糖、胞外蛋白和胞外eDNA。

1)胞外多糖的测定。将动态组样品沉降1 h去除上清液,加入生理盐水离心(4 000 r/min)10 min,加入0.1 mol/L NaOH重悬并进行间断超声处理,处理方式同1.3.1.3节。取1 mL上清液添加到体积分数99.5%乙醇中,4 ℃存放1 h,8 000 r/min离心10 min,将沉淀重悬后,加入6 g/100 mL苯酚和浓硫酸,测定OD490以表征胞外多糖含量。生物被膜胞外多糖含量计算见式(2)。

胞外多糖含量=OD490(动态组胞外多糖)-OD490(载体胞外多糖) 。

(2)

2)胞外蛋白的测定。将超声处理后动态组样品的上清液采用BCA蛋白试剂盒测定胞外蛋白质量浓度,计算见式(3)。

ρ(胞外蛋白)=ρ(动态组胞外蛋白)-ρ(载体组胞外蛋白) 。

(3)

3)胞外eDNA的测定。超声处理后动态组样品的上清液采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取eDNA,胞外eDNA质量浓度的计算见式(4)。

ρ(胞外eDNA)=ρ(动态组胞外eDNA)-ρ(载体组胞外eDNA) 。

(4)

1.3.1.5 生物被膜含量的测定

参照胡安祺等[13]的方法进行生物被膜含量的检测。将振荡培养条件下的生物被膜晾干后加入SYBR Green I单染,于暗室内静置孵育15 min以进行荧光染色,随后取出盖玻片并用磷酸缓冲液(PBS)冲洗3次,最后用激光共聚焦显微镜在520 nm发射波长处收集荧光信号并进行观察。

1.3.1.6 生物被膜微观结构的观察

使用扫描电镜观察振荡培养条件下生物被膜微观结构变化。动态组样品进行离心(1 000 r/min)2 min,取沉淀使用4 g/100 mL戊二醛固定后乙醇梯度洗脱(50%、70%、90%、100%),每次脱水过程持续15 min,完成临界点干燥后随即进行镀金处理,以增强样品的导电性。最后利用扫描电子显微镜对样品生物被膜微观结构进行观察。

1.3.2 振荡培养条件下被膜态双歧杆菌Gr24抗冷冻胁迫能力的测定

测定低温胁迫、细胞壁细胞膜完整性和ATP酶活性以评估振荡培养条件下被膜态双歧杆菌的抗冷冻胁迫作用。

1.3.2.1 存活率的测定

将振荡培养条件下的被膜态双歧杆菌(1.0×109 CFU/mL)置于24孔板中,在低温(4 ℃和-20 ℃)条件下分别处理1～7 d,进行益生菌计数。存活率的计算见式(5)。

存活率=胁迫处理后益生菌数/胁迫处理前益生菌数× 100% 。

(5)

1.3.2.2 细胞壁完整性的测定

将振荡培养条件下的被膜态双歧杆菌(1.0×109 CFU/mL)接种在不含溶菌酶的培养基和含溶菌酶(80 μg/mL)的培养基上,梯度稀释后进行益生菌计数,按式(6)计算细胞壁损伤率。

细胞壁损伤率=(无溶菌酶培养基中活细胞数-含溶菌酶培养基中活细胞数)/无溶菌酶培养基中活细胞数× 100% 。

(6)

1.3.2.3 细胞膜完整性的测定

将振荡培养条件下的被膜态双歧杆菌(1.0×109 CFU/mL)接种在不含NaCl的改良MRS培养基和含NaCl的改良MRS培养基上,梯度稀释后进行益生菌计数,按式(7)计算细胞膜损伤率。

损伤率=(不含NaCl的培养基中活细胞数-含有NaCl的培养基中活细胞数)/不含NaCl的培养基中活细胞数× 100% 。

(7)

1.3.2.4 ATP酶活性的测定

将振荡培养条件下的被膜态双歧杆菌(1.0×109 CFU/mL)离心得到沉淀,利用Ca2+、Mg2+、Na+/K+ ATP酶活性测定试剂盒进行ATP酶活性的测定。

1.3.3 振荡培养条件下被膜态双歧杆菌Gr24冰淇淋品质的测定

1.3.3.1 益生菌冰淇淋的制备

振荡培养条件下被膜态双歧杆菌的培养同1.3.1.1节,将样品沉降后离心(4 000 r/min)10 min, 收集沉淀。参考赖田甜等[14]的方法制作冰淇淋。将全脂牛奶、4 g/100 g的脱脂奶粉、20 g/100 g的白砂糖混合后搅拌20 min后,加入12 g/100 g的奶油,形成奶油状半固体,同时加入0.8 g/100 g的复合稳定剂,搅拌均匀。将混合物在80 ℃下灭菌20 min,冷却后加入菌泥沉淀,并在4 ℃老化24 h后放入-20 ℃的超低温冰箱冷冻。

1.3.3.2 益生菌冰淇淋营养成分的测定

1)蛋白质质量比测定。使用凯氏定氮法精确测定总蛋白质质量比[15]。将冰淇淋放入凯氏定氮瓶中,注入浓硫酸进行消化直至呈透明绿色,再加入40 g/100 mL NaOH、蒸馏水、甲基红指示剂进行蒸馏,最终用0.1 mol/L标准盐酸滴定至微黄色。冰淇淋蛋白质质量比(g/100 g)按式(8)计算。

w(蛋白质)=[V(滴定)-V(空白)]×c(盐酸)×0.014/m(样品)×6.38 。

(8)

式(8)中,0.014为与标准盐酸滴定溶液相当的氮含量,g/mmol;6.38为乳制品的蛋白质换算系数。

2)脂肪质量比测定。使用索氏提取法提取并量化冰淇淋中的脂肪质量比[15]。称量滤纸袋质量(m0)和样品及滤纸袋质量(m1),加入索氏提取器中并加入石油醚,将冷凝器和接收器置于95 ℃恒温水浴锅提取。提取后取出滤纸袋,待石油醚挥发后在100～105 ℃的烘干机内烘烤20 min,放入干燥器内冷却10 min,再次准确称重(m2)。冰淇淋脂肪质量比(g/100 g)按式(9)计算。

w(脂肪)=[(m1-m2)×

(1-w(水)]/(m1-m0) 。

(9)

1.3.3.3 益生菌冰淇淋理化特性的测定

1)膨胀率的测定。取等质量的冷冻前和冷冻后的冰淇淋测定体积,按式(10)计算膨胀率。

膨胀率=(V后-V前)/V前× 100% 。

(10)

2)融化率的测定。将冰淇淋样品放在金属丝网筛(0.5 cm×0.5 cm)上,25 ℃融化80 min称重,按式(11)计算融化率。

融化率=(m后/m前)×100% 。

(11)

3)硬度的测定。参考王剑泽等[16]的方法使用质构分析仪对冰淇淋样品进行硬度测定。硬度以探针穿透时的峰值压缩力(F)来衡量。

4)黏度的测定。使用黏度计对冰淇淋样品进行黏度测定,测试条件为25 ℃、2.5 r/min、30 s。

1.3.3.4 益生菌冰淇淋益生菌数的测定

参考GB 4789.35—2016《食品微生物学检验 乳酸菌检验》,采用平板计数法测定冰淇淋中的动物双歧杆菌Gr24活菌数。分别在以下关键时间节点取样测定:初始数量为混合料接种均质后的益生菌数;老化后为混合料经4 ℃、4 h老化结束时的益生菌数;冰淇淋完成凝冻硬化后,以正式进入-18 ℃冷冻储存的起始时间点记为0周,后续分别于储存4、8、12、16、18、19周取样测定。称取25 g冰淇淋样品,加入225 mL无菌生理盐水均质,梯度稀释后取0.1 mL稀释液涂布于含L-半胱氨酸盐酸盐的MRS琼脂平板,37 ℃厌氧培养48 h后计数,结果以lg (CFU/g)表示。

1.3.3.5 益生菌冰淇淋的感官评价

由10名男性和10名女性组成的感官评价小组对益生菌冰淇淋感官品质进行评估。评估指标包括颜色、组织状态、风味、融化质量和整体可接受性,以1～10的等级进行评级,其中1为不喜欢,10为非常喜欢,具体评分标准见表1。

1.3.3.6 益生菌冰淇淋益生特性的测定

1)黏附能力的测定。将3.0×105 cell/mL的Caco-2细胞接种到12孔板中,孔中加入含冰淇淋溶液的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM),37 ℃共孵育2 h。随后,使用胰蛋白酶获取孔中的贴壁细胞和双歧杆菌,并通过稀释板计数测定益生菌数。按式(12)计算黏附率。

黏附率=2 h双歧杆菌数/0 h双歧杆菌数×100% 。

(12)

2)模拟胃肠液耐受性的测定。将冰淇淋溶液与pH值为 2.5的胃蛋白酶(0.01 g/mL)模拟胃液(SGF)培养2 h。将1 mL混合物转移到pH值为6.8的胰蛋白酶(0.01 g/mL)模拟肠液(SIF)中培养4 h,分别进行益生菌计数。按式(13)计算存活率。

存活率=模拟胃肠液处理后益生菌数/模拟胃肠液处理前益生菌数× 100% 。

(13)

3)抗氧化能力的测定。将冰淇淋液离心(12 000 r/min)4 min,取上清液,采用DPPH自由基清除能力和T-AOC总抗氧化能力试剂盒进行总抗氧化能力的检测。

1.4 数据处理

所有实验重复进行3次,数据表示为平均值±标准偏差。选用Graphpad Prism 9.0进行数据处理、SPSS Statistics 25进行单因素方差分析、Duncan多区间检验进行显著性评价(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 被膜态动物双歧杆菌Gr24振荡培养条件的确定

2.1.1 不同载体对培养基pH值的影响

本研究选择5种常见纤维质食品材料,通过测定pH值、载体粒径、EPS含量成膜率、生物被膜含量和微观结构,评估动物双歧杆菌Gr24在不同载体上的生物被膜形成情况,筛选最佳载体以确定被膜态动物双歧杆菌Gr24振荡培养条件。

基于不同载体的动物双歧杆菌Gr24振荡培养时pH值的变化见图1。由图1可以观察到,随着培养时间的延长和营养物质的消耗,浮游组、静态组和动态组的pH值都呈逐步下降的趋势,并在24 h后pH值趋于平稳。在5种载体中,以豌豆壳为载体的静态组pH值比浮游组降低了0.23,这可能是由于豌豆壳的多孔结构提供了菌株的黏附表面,促进菌株增殖和产酸。豌豆壳动态组中,pH值在12 h内从7.01迅速降低到4.11,说明以豌豆壳为载体的动态组发酵时间相较于其他载体可能提前了12 h。此外,豌豆壳动态组的最终pH值为3.85,其他载体组的最终pH值均在4.00以上,说明豌豆壳动态组的菌株活跃程度更高,可以产生更多的酸。这可能是由于流体运动增强了营养物质的均匀分布和微生物对营养物质的吸收,延长了微生物生长和发酵的时间,提高了强度[17]。结果表明,基于不同载体的振荡培养对菌株代谢活动具有推动作用,需要进一步探究菌株代谢产物生物被膜的形成情况。

2.1.2 不同载体对载体粒径的影响

粒径反映不同载体上生物被膜的厚度及分布情况,基于不同载体的动物双歧杆菌Gr24振荡培养时载体粒径的变化见图2。由图2可知,12 h时豌豆壳动态组粒径显著增加了2 377.78 nm(P<0.05),其次是麸皮动态组粒径增加了457.6 nm,而其他载体在12 h时并没有显著的粒径变化(P>0.05),进一步验证了豌豆壳组发酵时间提前12 h的实验结果。24～48 h的动态组粒径普遍大于载体组,其中豌豆壳在24 h时粒径达到最大值(4 832.12 nm),并在24～36 h保持稳定,表明豌豆壳载体表面形成的生物被膜厚度增大,在24 h具有最佳成膜量并伴随累计效应,延长了生物被膜对菌株的保护时间。豌豆壳的多孔性质增强营养物质的可用性与有效分布,从而加速生物被膜的成熟过程;随培养时间延长,EPS不断积累形成额外生长层,使生物被膜厚度增加[17]。

2.1.3 不同载体对菌株成膜率的影响

为了更全面评估动物双歧杆菌Gr24在不同载体上的成膜能力,以成膜率为关键指标进行量化分析见图3。豌豆壳动态组的菌株24 h时达到最高生物被膜形成率和成膜益生菌数,分别为91.2%和7.80×108 CFU/mL[图3(b)];其次是麸皮动态组,成膜率在36 h最高(75.7%),成膜益生菌数为5.36×108 CFU/mL;而阳离子淀粉动态组成膜率最高仅为24%,这与EPS实验结果一致。这可能是由于与阳离子淀粉和甲壳素相比,豌豆壳表面多孔且粗糙,为微生物附着提供了较大的比表面积。此外,豌豆壳的天然组成中可能具备与微生物细胞或其EPS进行相互作用的官能团或分子[18]。豌豆壳静态组在36 h时成膜率和益生菌数最高,达到56.34%和5.38 × 107 CFU/mL[图3(d)],豌豆壳浮游组的最大存活细菌数为8.88×106 CFU/mL,说明豌豆壳的多孔结构为菌株提供了更多的黏附位点,进而促进生物被膜的生长,有效保护低酸、低营养环境下的菌株活性。与静置培养相比,豌豆壳动态组成膜率和成膜益生菌数分别显著增加了46.67%和 3.80×107 CFU/mL(P<0.05),且最佳成膜时间提前12 h。这可能是由于剪切应力使营养和氧气均匀扩散,促进生物被膜的生长。此外,振荡培养产生的向心力更有效地去除了分离细胞和碎片,降低了生物膜分散的风险,确保了更稳定的生物膜结构[19]。

2.1.4 不同载体对菌株EPS含量的影响

生物被膜的关键构成成分是EPS,对生物被膜组成成分的分析可间接揭示生物被膜的实际含量。基于不同载体的动物双歧杆菌Gr24振荡培养时EPS含量的变化见图4。由图4可知,与其他载体相比,该菌株在豌豆壳上表现出最高的EPS含量,胞外多糖含量、胞外蛋白和胞外eDNA质量比分别为1.54、0.85 mg/mL和9.56 ng/mL,说明生物被膜的形成可能是得益于EPS含量的增多,进而增加了生物被膜的厚度。此外,在24 h时豌豆壳上菌株的EPS含量达到最大值,24～36 h下降缓慢,该结论与粒径变化的结果一致,表明动物双歧杆菌Gr24在豌豆壳载体上形成大量生物被膜且较佳成膜时间为24 h。

2.1.5 不同载体对生物被膜生成量的影响

激光共聚焦电子显微镜观察到的生物被膜生成量和益生菌数变化见图5。与静态组[图5(e)]相比,豌豆壳动态组[图5(b)]绿色荧光强度更强,说明豌豆壳载体上生物被膜形成量更大,益生菌数更多。

2.1.6 不同载体对生物被膜形态的影响

通过扫描电镜可直观观察动物双歧杆菌Gr24在不同载体上的生物被膜形态和微观结构的变化(图6)。如图6所示,豌豆壳和大豆膳食纤维载体[图6(c)、(e)]显现出不规则空间褶皱,并具有大量粗糙空腔;麸皮和阳离子淀粉[图6(a)、(i)]颗粒度小,碎片化明显,空腔较小;而甲壳素[图6(g)]表面则相对光滑,几乎没有缝隙。Cheow等[20]报道指出,表面多孔的材料显著促进了生物被膜的附着和滞留,控制微生物进一步沉积。因此,在豌豆壳表面黏附的被膜态菌株最多,并直观观察到大量EPS的产生;而甲壳素表面相对光滑,附着菌株的能力极其有限,未观察到生物被膜形成。Grossova等[6]研究表明,不同载体包括马铃薯纤维、海藻酸钠以及燕麦纤维等用于益生菌发酵,益生菌在其表面形成生物被膜的能力存在显著差异,与本实验结果基本一致。结果表明,豌豆壳是动物双歧杆菌Gr24较为合适的成膜载体,可形成大量生物被膜且成膜时间缩短至24 h,可进一步探究其在益生菌冰淇淋中的应用潜力。动物双歧杆菌Gr24生物被膜的优化振荡培养条件为以2 g/100 mL豌豆壳为载体,在37 ℃、120 r/min条件下培养。

2.2 振荡培养条件下被膜态双歧杆菌Gr24抗冷冻胁迫能力分析

为了探究振荡培养条件下动物双歧杆菌Gr24的抗冷冻胁迫能力,测定了不同温度(4 ℃和-20 ℃)条件下菌株存活率、细胞损伤率及ATP酶活性(图7)。由图7(a)可知,在冷藏胁迫(4 ℃)条件下,随着时间的延长,菌株存活率呈现下降趋势,其中动态组和静态组存活率略高于浮游组;在冷冻胁迫(-20 ℃)条件下,浮游组存活率在2 d后开始急剧下降,7 d存活率仅有32.5%,而静态组和动态组存活率下降趋势缓慢,7 d存活率高达55.15%和69.83%,提高了近0.70倍和1.15倍[图7(b)],说明振荡培养对冷冻胁迫下的被膜态双歧杆菌Gr24具有更好的保护作用。

冷冻压力会导致细胞内外形成冰晶,一方面形成对细胞外部的机械压力造成物理损伤,另一方面导致细胞内部溶质浓度升高,造成脱水和渗透压失衡。因此,细胞膜和细胞壁的损伤率是评价抗冷冻胁迫能力的重要指标。如图7(c)所示,浮游组细胞膜和细胞壁损伤率分别为43.60%和51.00%,而动态组分别为21.00%和25.00%,比浮游组降低了50%,说明振荡培养条件下被膜态双歧杆菌Gr24显著缓解了冷冻对菌体细胞的损伤。

ATP酶是将ATP水解成ADP和无机磷酸盐并释放能量的酶,这种能量是维持跨膜离子梯度和细胞稳态所必需的[21]。在冷冻胁迫下,维持这些梯度对于防止细胞冷冻损伤至关重要。如图7(d)所示,浮游组的Mg2+、Ca2+、Na+/K+ ATP酶活性分别为18.78、17.45、19.92 U/mg,而动态组分别为34.35、32.54、33.84 U/mg,是浮游组的1.8倍、1.8倍和1.7倍,说明振荡培养条件下被膜态双歧杆菌Gr24显著缓解了冷冻导致的ATP酶失活,进而缓解了细胞损伤。

Heumann等[11]研究表明,相较于浮游菌株,被膜态副干酪乳杆菌ATCC 334展现出对低温胁迫更为显著的耐受性,与本实验结论基本一致。这可能是由于生物被膜的胞外基质可以结合水,降低细胞周围水活度,从而在低温下减小冰晶破坏细胞膜的可能性。与浮游菌株相比,被膜态菌株代谢活动随环境变化发生响应,在低温环境下生物被膜内细胞进入休眠状态,减少冷冻胁迫对细胞的破坏[22]。此外,与其他农副产品组织相比,豌豆壳的含水量低,降低了冰晶形成破坏内部生物被膜细胞结构的风险[23]。振荡培养在剪切应力的作用下使营养物质持续均匀流动,代谢物、副产物随向心力被去除,形成更厚的生物被膜基质,更好地保护细胞免受冷冻损伤。进一步说明,振荡培养条件下被膜态双歧杆菌Gr24具有更强的抗冷冻胁迫能力。因此,振荡培养条件下被膜态双歧杆菌Gr24具备在冰淇淋中的应用潜能。

2.3 振荡培养条件下被模态双歧杆菌Gr24冰淇淋品质分析

2.3.1 益生菌冰淇淋营养成分分析

冰淇淋为益生菌生长提供足够的营养物质,同时益生菌的添加可为解决冰淇淋产品营养价值低的问题提供新策略。动物双歧杆菌Gr24冰淇淋营养成分如表2。冰淇淋的脂肪质量比由于动物双歧杆菌的加入降低了2.00 g/100 g及以上,这与之前研究中嗜酸乳杆菌CICC 6075降低冰淇淋产品脂肪含量的结果一致[24]。其中动态组显著降低了6.23 g/100 g,有研究表明脂肪酶在生物被膜环境中更为活跃,导致脂肪更有效地降解。此外,振荡培养促进被膜态细胞间更好的营养和代谢物交换,提高了脂肪降解过程的整体代谢活性和效率[25]。动态组蛋白质质量比比对照组显著增加了2.02 g/100 g,这可能是由于振荡培养后生物被膜表现出更高水平蛋白质分泌量,通过养分的有效利用促进了微生物生长和蛋白质合成,从而使蛋白质更多地释放到冰淇淋中[26]。因此,振荡培养条件下被膜态双歧杆菌Gr24可有效降低益生菌冰淇淋中脂肪含量,增加蛋白质含量。

2.3.2 益生菌冰淇淋理化特性分析

为探讨振荡培养条件下被膜态双歧杆菌Gr24对冰淇淋理化性质的影响,对益生菌冰淇淋的黏度、硬度、膨胀率和融化率进行了检测,结果见表3。由表3可知,浮游组、静态组和动态组的冰淇淋黏度与对照组相比,分别提高了5.57%、20.94%和28.81%。豌豆壳作为一种富含大量非可溶性纤维的益生元,能够形成水合纤维素网络,增加固形物含量和黏度[27]。此外,这种动态环境促进了EPS的整合,EPS存在于乳蛋白质网络结构聚集体之间的孔隙中,有助于提高冰淇淋的黏度[28]。浮游组冰淇淋的硬度与对照组相比没有显著差异,但是动态组样品硬度最大,比对照组增加了50.16%,这一特性反映出动态组对冰淇淋形变具有更为显著的抵抗能力。这可能是由于豌豆壳粗纤维颗粒的存在提升了冰淇淋整体结构的完整性和密度,并通过吸收水分子形成化学键来增加样品硬度[25]。有研究表明,冰淇淋的硬度变化与可溶性固形物含量增加有关,硬度过高减弱了产品的膨胀性能[3]。

与黏度和硬度的变化相反,对照组样品的膨胀率为39.01%,浮游组、静态组和动态组样品的膨胀率分别为38.61%、30.11%和29.13%,其中动态组膨胀率降低了9.88%。这可能是由于生物被膜形成EPS网络有效地捕获和保留气泡,从而阻碍了冰淇淋中空气的膨胀,导致较低的膨胀率[29]。豌豆壳的存在增加了冰淇淋体系的黏稠度,从而阻止空气的进入,进一步限制膨胀。此外,振荡培养条件可以形成更致密的生物膜基质,增加对冰淇淋混合物的机械应力,使空气更难被吸收和保留[30]。有研究表明,冰淇淋的各理化性质之间也存在一定的相关性,冰淇淋融化速度与脂肪含量、蛋白质组成、空气膨胀率以及黏度有关[3]。由表3可知,浮游组、静态组和动态组样品的融化率分别为45.10%、40.10%和36.97%,均低于对照组,动态组的抗融性最好。这可能是因为其相应的膨胀率较低。此外,Bruno等[31]也发现豌豆壳中含有大量的豌豆蛋白,作为乳化剂和稳定剂可以显著降低冰淇淋的融化率和膨胀率,这与本研究结论一致。因此,振荡培养条件下被膜态双歧杆菌Gr24的添加可有效提高冰淇淋的黏度和硬度,降低膨胀率和融化率。

2.3.3 益生菌冰淇淋储藏期益生菌数分析

益生菌冰淇淋在冷冻储藏过程中,其内部益生菌数量会随时间的推移而发生动态变化。鉴于此,确保产品在整个货架期内维持稳定的生物活性至关重要。图8为振荡培养条件下被膜态双歧杆菌Gr24冰淇淋益生菌存活情况。经老化处理后,冰淇淋益生菌数随储藏时间的延长呈现逐渐下降的趋势。其中动态组下降趋势缓慢,最终益生菌数最多,为6.24 lg(CFU/g),较浮游组提高了1.5倍,且益生菌数量一直维持在其发挥生理功效的最小阈值6.0 lg(CFU/g)以上;而浮游组和静态组最终益生菌数均低于最小阈值。可能是动态条件下成熟生物被膜的存在起了关键作用,显著提高了菌株自身抗冷冻能力,这与前期抗冷冻胁迫数据相符。其次豌豆壳为益生菌提供了保护壳,保护益生菌免受机械应力和冻融损伤,并为冰淇淋提供少量蛋白质、粗多糖等营养物质,间接影响益生菌的生长[30]。已有研究表明,椰子渣中的营养成分和纤维可保护冰淇淋在储存期间的益生菌活力[15]。因此,振荡培养条件下被膜态双歧杆菌Gr24有效增加了益生菌冰淇淋储藏期间的益生菌数。

2.3.4 益生菌冰淇淋感官特性分析

动物双歧杆菌Gr24冰淇淋的感官评价结果见图9。由图9可看出,添加了益生菌的冰淇淋在总体评分上与对照组存在显著差异,说明添加益生菌能有效抑制冰晶的生成,进而对冰淇淋的质地与口感产生积极影响。冰淇淋的感官评分整体接受度由高到低依次为动态组、静态组、浮游组、对照组。其中,动态组的冰晶结构和融化质量分最高,较对照组显著提高(P<0.05),浮游组颜色和风味分较其他组高。原因可能是豌豆壳载体会导致沙砾感,容易被口腔感觉识别。最近的一项研究发现,在冰淇淋中加入橘子皮和果肉分离纤维不会明显降低消费者对冰淇淋的购买偏好,尽管会对产品的口味产生负面影响[32]。

2.3.5 益生菌冰淇淋益生特性分析

耐胃肠液特性、体外黏附性和抗氧化特性是益生菌发挥生物功能的必要益生特性。本研究对冰淇淋储藏后动物双歧杆菌Gr24的益生特性进行了分析,结果见图10。

2.3.5.1 胃肠环境耐受性分析

胃肠道中强酸环境、胆盐及消化酶会破坏菌株细胞膜,降低菌株存活率。双歧杆菌对胃肠道环境是否具有耐受性、能否顺利到达肠道是其发挥益生功能的基础条件。由图10(a)可知,在模拟胃液中培养2 h后,浮游组和静态组菌株存活率分别下降到32.33%和54.66%,而动态组菌株存活率高达68.00%。在模拟肠液中培养4 h后,浮游组菌株存活率持续下降到22.33%,而静态组和动态组的存活率变化趋于平缓,分别为51.00%和67.66%。这可能是因为冷冻过程中菌体的细胞膜受到损伤,加快了胃肠液的不良影响,然而生物被膜的存在很好地缓解了冷冻环境及肠液中胰蛋白酶对菌株的损伤。与本研究结果类似,Ergin等[33]发现,冰淇淋贮藏过程中,嗜酸乳杆菌CICC 6075经微胶囊生物膜包埋后,显著提高了耐胃酸性能。此外,由于生物被膜中的EPS在微生物细胞周围形成了三维结构的保护屏障,使微生物免受胃肠道中酸性pH值、胆汁盐和消化酶等恶劣条件的影响[29]。豌豆壳富含纤维素和木质素,这种天然纤维结构具有很强的抗胃肠道酶降解能力,并保护豌豆壳内微生物不与消化酶和酸直接接触[30]。此外,动态组与静态组的存活差异主要是由于菌株对流体剪切力表现出环境响应性,促进EPS的产生以抵消剪切效应[19]。

2.3.5.2 细胞黏附性分析

双歧杆菌在胃肠道中的有效黏附和定植是其在体内发挥益生功能的前提。如图10 (b)所示,细胞黏附率从高到低依次为动态组(43.43%)、静态组(26.69%)、浮游组(12.02%)。结果表明,生物被膜态比浮游态益生菌具有更好的黏附细胞的能力,原因可能是冰淇淋贮藏期间,菌体本身的黏附性有所降低,相对而言,生物被膜中部分胞外多糖和糖蛋白能够介导双歧杆菌与肠道细胞间的特异性相互作用,在一定程度上维持菌体的黏附性[29]。此外,豌豆壳通过疏水相互作用促进细胞的黏附[34]。

2.3.5.3 抗氧化性分析

研究发现双歧杆菌展现出显著的抗氧化能力,其能够有效加速体内自由基的清除,减少自由基参与氧化反应[35]。因此,运用DPPH自由基清除能力、T-AOC总抗氧化能力评估振荡培养条件下被膜态双歧杆菌Gr24的抗氧化能力。如图10(c)和图10(d)所示,动态组DPPH自由基清除率和总抗氧化能力均为3组最高,分别为70.43%和0.430 0 mmol/L,其次是静态组(46.43%、0.240 6 mmol/L),浮游组(31.51%、0.140 2 mmol/L),动态组与浮游组相比,抗氧化活性提高了约2.07倍,DPPH自由基清除率提升约1.24倍。结果表明,动态组成膜双歧杆菌Gr24抗氧化能力更强。DPPH自由基清除能力和总抗氧化能力与胞外多糖、表面蛋白等活性物质含量有关。生物被膜含有大量EPS,其中胞外多糖可与其他化合物协同作用引起抗氧化能力的增加[29]。进一步研究发现,发酵会诱导细胞壁结构分解,振荡培养条件下的提前发酵有助于细胞壁分解,从而促进抗氧化物质的提前合成和释放。因此,振荡培养条件下被膜态双歧杆菌Gr24有效提高了冰淇淋的益生作用。

3 结 论

本研究确定了双歧杆菌Gr24生物被膜振荡培养条件,考察了此条件下被膜态菌株的抗冷冻胁迫能力,并探究了其在益生菌冰淇淋中应用的可行性。结果表明,以豌豆壳为载体的振荡培养具有最大的生物被膜形成量且优化成膜时间缩短至24 h;振荡培养条件下被膜态双歧杆菌Gr24可提高菌株在冷冻环境中的存活率和ATP酶活性,降低细胞膜、细胞壁的损伤率,具有在冰淇淋中应用的潜能。将振荡培养条件下被膜态双歧杆菌Gr24添加至冰淇淋中,显著降低了冰淇淋脂肪含量,增加了蛋白质含量,且使冰淇淋的黏度和硬度提高,膨胀率和融化率降低;由于生物被膜紧密的结构很好地保护了菌体,冰淇淋中动物双歧杆菌Gr24的冷冻储藏活性和益生特性明显提高。振荡培养条件下被膜态双歧杆菌Gr24为提高益生菌冰淇淋中菌株存活率提供了一种新的技术方法。后续研究将利用动物模型探究该菌株在体内的有益作用,进一步解析其作用机制。

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Preparation of Biofilm-State Bifidobacterium animalis Gr24 and Its Application in Probiotic Ice Cream

SUN Haoxuan1, LIU Qi1, ZHU Zekang1, DU Jing1, LIU Guorong1,2,*

(1. School of Food and Health, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China;2. Key Laboratory of Geriatric Nutrition and Health, Ministry of Education/Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

Abstract： In order to solve the problem of low probiotic activity and poor application effect, the biofilm forming differences of Bifidobacterium animalis (B. animalis) Gr24 on five different carriers were evaluated. The optimal carrier was selected to determine the shaking culture conditions of B. animalis Gr24 biofilm, and its ability to resist freezing stress was analyzed, and the effects of biofilm-state B. animalis on the nutrient composition, physicochemical characteristics, storage characteristics, and probiotic properties of ice cream under shaking culture conditions were explored. The results showed that B. animalis Gr24 had the strongest biofilm-forming ability on pea hulls, and the optimal biofilm-forming time was shortened to 24 h. Freezing stress resistance analysis showed that biofilm-state B. animalis Gr24 under shaking culture conditions alleviated the damage of cell membranes and cell walls and the loss of ATPase activity, and the survival rate of the biofilm-state strains increased by 1.15 times compared with planktonic strains. The addition of shaking-cultured biofilm-state B. animalis Gr24 significantly reduced fat content and increased protein content of ice cream, improved product viscosity and hardness, and reduced expansion rate and melting rate, and stabilized probiotic viability, with a 1.5-fold increase in 18-week viable counts compared with planktonic strains. In addition, post-storage probiotic properties showed that low temperature storage significantly improved gastrointestinal environment resistance, intestinal epithelial cell adhesion and antioxidant activity of shaking-cultured biofilm-state strains. In conclusion, the shaking culture conditions significantly improved the biofilm-forming efficiency and the freezing stress resistance of B. animalis Gr24, which could ensure the good quality characteristics of the ice cream while improving its functional activity. This study aimed to lay the industrial technological foundation for the further development of highly resistant probiotic foods.

Keywords： biofilm; Bifidobacterium animalis; pea hulls; shaking culture; ice cream

doi：10.12301/spxb202400589

文章编号：2095-6002(2026)03-0151-17

引用格式：孙灏璇,刘琦,朱泽康,等. 被膜态双歧杆菌Gr24的制备及其在益生菌冰淇淋中的应用[J]. 食品科学技术学报,2026,44(3):151-167.

SUN Haoxuan, LIU Qi, ZHU Zekang, et al. Preparation of biofilm-state Bifidobacterium animalis Gr24 and its application in probiotic ice cream[J]. Journal of Food Science and Technology, 2026,44(3):151-167.

中图分类号： TS201.3

文献标志码： A

收稿日期： 2025-01-10

基金项目： 国家自然科学基金面上项目(31871772); 广东省基础与应用基础研究基金项目(2022A1515140021)。

Foundation: National Natural Science Foundation of China (31871772); Guangdong Provincial Basic and Applied Basic Research Fund Project (2022A1515140021).

第一作者： 孙灏璇,女,硕士研究生,研究方向为微生物代谢产物。

*通信作者： 刘国荣,女,教授,博士,主要从事微生物代谢产物方面的研究。

(责任编辑：张逸群)