溃疡性结肠炎(UC)是一种非特异性炎症性肠病,具有持续性腹泻、痉挛性腹痛、黏液脓血便、体重下降等典型临床表现[1]。UC病程长、复发率高,且有导致结肠癌的风险,严重危害人体健康。目前临床上有多种治疗UC的药物,然而,常用的一线药物存在停药后易复发、长期使用副作用大等问题。近年来,天然多糖因能够调节炎症介质、调控肠道菌群稳态并促进肠黏膜修复,展现出缓解UC的潜在应用价值[2]。

黑木耳(Auricularia auricula)作为黑木耳属的担子菌,具有基本的食用和药用特性。黑木耳多糖(AAPs)是黑木耳子实体中的重要功能成分,能通过抗氧化、抗炎及免疫调节等多重途径干预结肠炎的病理过程[3]。然而,黑木耳作为担子菌亚门的真菌,细胞壁结构与植物不同,其壁层厚实、质地坚固,破碎难度远超植物细胞壁[4]。目前,黑木耳多糖提取方式主要有物理机械法、化学法、生物酶法以及复合法。物理机械法依靠外界力量(超声波、电磁波等)破壁,普遍存在着设备要求高、能耗大、易产生局部高温等不足;化学法中的热水提取,多糖得率低、提取时间长,而酸与碱易引入杂质且存在环境污染。单一生物酶破壁效果不佳,多种酶结合可提高AAPs提取得率但成本高。复合法虽有助于提高多糖得率,但增加了操作工序与生产成本[5]。因此,目前亟须开发一种在保证多糖高产率的同时,可以降低能耗、减少有机溶剂使用、简化工艺流程的新型、环保、高效的提取方法。

H2O2是一种清洁高效的氧化剂,处理过程中可以被分解为水与氧气,产物中无其他残留[6]。在H2O2中引入特定物质[抗坏血酸(Vc)等],这个体系则变为Fenton试剂或类Fenton试剂。Vc是一种强还原剂,与H2O2共存时可发生一系列电子转移反应,能持续产生高活性的羟基自由基(·OH)[7]。 采用H2O2与H2O2-Vc两种方式提取多糖,产物得率高,绿色环保且无须增加设备投入。然而,目前这2种提取方式对多糖分子质量、微观形貌及其抗溃疡性结肠炎活性的影响还不清楚。

本研究拟采用H2O2和H2O2-Vc两种方式分别提取AAPs,研究2种AAPs的分子质量与微观形貌差异并与其功能活性进行关联分析。通过葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导建立小鼠UC模型,比较2种提取方式的多糖对小鼠疾病活动指数、抗氧化指标、炎症因子以及肠道菌群的影响,希望为后续深入研究(无菌动物定植实验、代谢组学分析等)提供依据并为黑木耳多糖功能性食品的开发提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑木耳,产自黑龙江省小兴安岭地区。健康雄性ICR小鼠(体重28～32 g),购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。美莎拉嗪(MES)药物,上海阿拉丁生化科技股份有限公司。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、脂多糖(LPS)检测试剂盒,南京建成科技有限公司。肿瘤坏死因子-α(TNF - α)和白细胞介素-6(IL-6)检测试剂盒,上海研生生物科技有限公司。实验所用其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

JP-250A-2型高速多功能粉碎机,上海市久品工贸有限公司;TG16-WS型台式高速离心机,湖南湘仪离心机仪器有限公司;UV1800PC型紫外可见光分光光度计,上海奥析科学仪器有限公司;KeyenceRE-52型旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂;1100型高效液相色谱仪,安捷伦科技(上海)有限公司;MC1000型离子溅射仪,国际化学与核公司;ZEISS GeminiSEM 300型扫描电子显微镜,德国蔡司显微系统有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 AAPs制备及结构分析

黑木耳粉碎过200目筛后,按照1∶85 (g/mL)料液比加入质量分数1.6%的H2O2,然后加入H2O2质量1/2的Vc,90 ℃条件下水浴提取180 min,8 000 r/min 离心20 min,取上清液。在上清液中加入4倍体积的无水乙醇,4 ℃下静置醇沉12 h,3 000 r/min离心10 min。取沉淀溶于去离子水,采用Sevag法[V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1]脱蛋白至溶液在紫外分光光度计280 nm下没有吸收峰,获得F-AAPs。在相同提取条件下,不加入Vc,获得 W-AAPs。 将F-AAPs与W-AAPs用于后续的小鼠实验。采用琼脂糖凝胶6FF对F-AAPs与W-AAPs进行纯化,去离子水洗脱,绘制洗脱曲线,收集洗脱曲线中的主峰,浓缩、冷冻干燥后得到AAPs-p,用于后续分子质量与微观形貌的测定。

1.3.1.1 APPs分子质量测定

将AAPs-p样品(20 mg)溶于10 mL的50 mmol/L Na2SO4水溶液,经0.45 μm膜过滤。采用高效液相色谱仪,Ultrahydrogel Linear凝胶柱(7.8 mm×300 mm,2 μm),流动相为0.1 mol/L NaNO3。采用 6种葡聚糖标准品,分子质量分别为0.505、1.2、5.0、25、150、670 kDa。标准方程为洗脱体积(TR)和lgMw的线性关系,利用线性回归方程的TR计算样品的分子质量。

1.3.1.2 2种AAPs显微结构观察

取AAPs-p样品1.0 mg,在离子溅射仪上镀膜,采用扫描电子显微镜(SEM)观察样品微观结构。

1.3.2 动物实验设计

将6周龄ICR雄性小鼠,适应性饲养1周后随机分为7组,即空白组、美沙拉嗪(MES)组、DSS诱导的模型组、高剂量W-AAPs组与低剂量 W-AAPs组(W-AAPs-H与W-AAPs-L)、高剂量F-AAPs组与低剂量F-AAPs组(F-AAPs-H与F-AAPs-L),每组8只小鼠。每天观察小鼠状态并记录体重。实验周期为28 d,具体实验步骤见表1。所有动物实验均依照美国国家研究委员会《实验动物护理与使用指南》规范开展,本研究已获中国计量大学动物研究伦理委员会批准,动物伦理审批号:2025-33。实验动物生产许可证号:SCXK(浙)2022-0005。实验动物使用许可证号:SYXK(浙)2023-0014。

表1 动物实验设计

Tab.1 Animal experiment design

分组1～21d22～28d饮用灌胃饮用灌胃空白组生理盐水去离子水生理盐水模型组生理盐水DSS生理盐水MES组去离子水100mg/(kg·d) MESDSS100mg/(kg·d) MESAAPs-H300mg/(kg·d) AAPsDSS300mg/(kg·d) AAPsAAPs-L150mg/(kg·d) AAPsDSS150mg/(kg·d) AAPs

DSS质量分数为2.2%。

1.3.3 2种多糖对小鼠抗溃疡性结肠炎活性的影响

1.3.3.1 小鼠每日疾病活动指数评分

每天观察小鼠粪便性状并记录,按文献标准对小鼠每日疾病活动指数(DAI)进行评分[8](表2)。

表2 小鼠DAI评分

Tab.2 Mouse DAI scoring

体重下降/%粪便性状便血情况评分/分0正常无隐血00～3粪便黏附在笼子上无隐血13～5软便和稀便粪便中隐血25～7中度腹泻伴不成形粪便粪便中隐血3>7水样便粪便中可见血迹4

1.3.3.2 样本采集及相关生化指标检测

小鼠禁食12 h后,通过眼眶窦采血,于4 ℃静置过夜后离心(3 000 r/min,15 min),收集上清液。根据试剂盒说明书测定超氧化物歧化酶(SOD)与谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,以及LPS含量。取小鼠完整结肠组织测定长度。从结肠中取新鲜粪便做肠道菌16S rRNA测序,即用Agilent 2100生物分析仪和Illumina的文库定量试剂盒进行评估,合格的文库浓度在2 nmol/L以上。使用NovaSeq 6000测序仪进行2×250 bp双端测序,对应的试剂为NovaSeq 6000 SP试剂套装(500个循环)。取小鼠结肠组织,在质量分数为4%的多聚甲醛中固定后脱水包埋,切片经苏木精-伊红(H&E)染色后用于观察。另取结肠组织用生理盐水经匀浆仪制成浓度10%的结肠组织匀浆液,离心后取上清液,依照试剂盒说明书测定TNF-α与IL-6含量。

1.4 数据处理

实验数据以平均值±标准偏差表示。采用IBM SPSS Statistics 25软件进行单因素方差分析,结合方差齐性检验和LSD事后检验,当P<0.05时判定为具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 2种AAPs的分子质量与微观形貌分析

2.1.1 2种AAPs的分子质量分析

根据本团队前期的研究基础,F-AAPs的重均分子质量(Mw)为87.646 kDa[9]。W-AAPs的高效凝胶渗透色谱(HPGPC)如图1。根据标准方程 lgMw=-0.549 9TR+13.774(R2=0.991 3),W-AAPs 的重均分子质量为301.89 kDa。可见 F-AAPs 的分子质量远低于W-AAPs,这与AAPs的提取方式密切相关。H2O2作为一种不稳定的化合物,加热条件下分解产生新生态氧,可以氧化破坏黑木耳细胞壁,使其结构变得疏松,促进AAPs溶出。这个过程相对缓慢,黑木耳细胞壁降解程度有限,获得的AAPs分子质量通常仍较大。而Vc与H2O2共存时能持续产生高活性的·OH(已知化学活性最强自由基之一),几乎无差别攻击所有生物大分子,高效破坏细胞壁结构,显著提高AAPs提取效率,增强了自由基对AAPs多糖链的降解作用(导致分子质量降低),并可能通过氧化作用改变了链内和链间的相互作用,从而破坏了原有的紧密聚集态,形成疏松结构,使Vc-H2O2法提取的APPs分子质量低于单独采用H2O2法。研究发现,低分子质量天然多糖具有强抗氧化活性[10]。

图1 W-AAPs的HPGPC

Fig.1 HPGPC of W-AAPs

2.1.2 2种AAPs的微观形貌分析

SEM是测定多糖表观物理结构最有效的方法之一。该方法简单易操作且对多糖样品污染小,可直接观察到多糖微观形貌[11]。对2种AAPs多糖进行SEM分析,其微观形貌见图2。由图2可知,F-AAPs 显示出“几捆绳子扭在一起”的麻花形态,表明具有线性或略带分支骨架,糖链上富含的大量羟基可通过分子间作用力将相邻分子链紧密黏合,进而形成三维缠结结构。绳子之间形成的空隙和孔洞,意味着F-AAPs具有较高的比表面积和多孔性结构。W-AAPs则呈现层状或片晶结构,与 F-AAPs 的“绳捆结构”中的三维缠结不同,其分子链间的氢键作用主要在二维平面内有序形成,即分子链像铺开的木板,通过氢键紧密地“黏合”成一个平面,多个平面堆叠形成“厚片”。

图2 2种AAPs微观形貌

Fig.2 Micro-morphology of two AAPs

2.2 2种AAPs对UC小鼠抗溃疡性结肠炎活性的影响

2.2.1 2种AAPs对UC小鼠体重及DAI评分影响

DSS诱导的小鼠UC模型因操作简单、成功率高且结果可复现性好,已成为目前应用最广泛的UC模型[12]。造模后小鼠出现体重明显下降、腹泻、便血等典型症状。

实验过程中各组别小鼠的体重以及DAI评分变化结果见图3。由图3(a)可知,由于在适应期和实验初始阶段,所有实验组小鼠体重均呈现缓慢增长趋势,各组间体重无差异,说明实验条件适合小鼠生长。灌胃DSS(第22～28天)过程中,模型组小鼠体重下降明显,体重由34.38 g下降至33.02 g,体重损失率达3.96%,表明DSS诱导的UC对小鼠的营养吸收、代谢等生理过程产生了严重干扰。MES组小鼠28 d体重与22 d比较,由31.81 g变为32.01 g,反而增长0.63%,说明阳性药物MES有效减轻了UC对小鼠体重的不良影响。在高剂量和低剂量组的W-AAPs干预下,小鼠体重分别由31.3 g变为27.275 g以及33.39 g变为32.85 g,在22～28 d损失率分别为12.86%与1.62%;高剂量和低剂量组的F-AAPs干预下,小鼠体重分别由30.33 g变为29.72 g以及由32.84 g变为32.375 g,在22～28 d损失率分别为2.01%与1.42%,均低于相同剂量的W-AAPs。表明与W-AAPs相比,F-AAPs能更好地缓解UC对小鼠体重的负面影响,维持体重的相对稳定。

图3 2种AAPs对UC小鼠生理状态影响

Fig.3 Effects of two AAPs on the physiological status of UC mice

小鼠疾病活动指数(DAI)评分用于评估UC严重程度。由图3(b)可知,空白组DAI评分始终维持在0分,表明正常环境下小鼠健康生长。模型组小鼠饮用DSS后第6天时DAI评分达2.3分,并出现明显粪便异常和直肠出血症状,与UC症状一致,说明UC模型建模成功。MES组小鼠DAI评分增加缓慢,第7天时仅为1.2分,表明MES有效抑制了UC病程发展。高剂量和低剂量组的W-AAPs干预的前6天,DAI评分介于模型组与MES组之间,第7天时低于MES组,表明W-AAPs的作用是一个温和且缓慢的过程。高剂量和低剂量组F-AAPs干预前5天,DAI评分介于模型组与MES组之间,第6天开始,DAI评分显著低于MES组(P<0.05),第7天时,高剂量F-AAPs的DAI评分显著低于高剂量和低剂量组的W-AAPs(P<0.05),表明F-AAPs比W-AAPs更能有效缓解小鼠稀便、血便等UC症状,且具有浓度依赖性。

2.2.2 2种AAPs对UC小鼠结肠长度与组织形态影响

小鼠结肠长度与UC严重程度呈负相关[13]。2种AAPs对小鼠结肠长度的影响,实验结果见图4。由图4可知,模型组小鼠结肠长度显著短于空白组,出现UC典型的结肠缩短现象。MES组小鼠结肠长度显著高于模型组(P< 0.05)。与模型组比较,2种AAPs均显著缓解结肠缩短(P<0.05),且 W-AAPs-L 与F-AAPs-H跟空白组与MES组比较无差异(P>0.05)。模型组小鼠结肠组织明显充血和水肿,而MES组与2种AAPs样品组结肠均未见明显水肿或充血,肠道内容物饱满呈颗粒状。

(b)图中不同小写字母表示组间数据差异显著(P<0.05)。

图4 2种AAPs对UC小鼠结肠长度影响

Fig.4 Effects of two AAPs on colon length in UC mice

DSS诱导的UC小鼠表现出中性粒细胞浸润、绒毛萎缩、隐窝扩张和肠肌层缺失等病理症状[14]。对小鼠的结肠组织进行了H &E染色处理,镜下观察结果见图5。由图5可见,空白组小鼠结肠组织切片未见炎性细胞浸润,杯状细胞和隐窝结构保存完好。模型组小鼠结肠黏膜下层出现明显的炎性细胞浸润,淋巴结局部灶性坏死等症状。MES组与2种AAPs样品组对结肠组织损伤均呈现不同程度的改善。其中F-AAPs-L组上皮细胞层损伤基本修复,但仍有炎症细胞浸润现象。高剂量和低剂量组的 W-AAPs 与F-AAPs-H组炎症细胞浸润面积降低,绒毛和隐窝结构完整。

图中黑色方框表示放大的区域。

图5 2种AAPs对UC小鼠结肠组织形态的影响

Fig.5 Effect of two AAPs on colon tissue morphology in UC mice

2.2.3 2种AAPs对UC小鼠生化指标影响

2种AAPs对UC小鼠有关肠道健康的生化指标影响结果见图6。肠道黏膜屏障在保护肠道免受炎症损伤方面发挥关键作用[15],肠道通透性可通过小鼠血清LPS水平反映[16]。图6(a)中,空白组小鼠血清LPS水平低,这与其完整的肠道屏障功能密切相关。相比之下,模型组小鼠的LPS水平显著提高(P< 0.05),表明小鼠肠道黏膜屏障完整性被破坏,导致大量LPS进入血液。MES组LPS水平显著低于模型组(P< 0.05),与空白组无差异(P>0.05),证明了MES疗效和本实验体系可靠性。与模型组比较,高剂量W-AAPs与F-AAPs均能显著降低LPS水平(P<0.05),效果与MES组相当(P>0.05)。低剂量W-AAPs与F-AAPs效果不同,前者的LPS水平能恢复至与空白组无差异的正常状态(P>0.05),而后者的LPS水平虽呈下降趋势,但与模型组无差异(P>0.05)。

不同小写字母表示组间数据差异显著(P<0.05)。

图6 2种AAPs对UC小鼠生化指标的影响

Fig.6 Effects of two AAPs on biochemical parameters in UC mice

炎症性肠病的发生与氧化应激和氧化还原信号传导中断有关[17]。图6(b)与(c)中,与空白组相比,模型组的SOD和GSH-Px活性均显著降低,表明UC模型引发了氧化应激状态。与模型组比较,高剂量和低剂量组的F-AAPs不仅能显著增强SOD活性(P<0.05),且效果优于MES组和W-AAPs [高剂量组F-AAPs的SOD活性为0.509 U/mg,分别比高剂量组W-AAPs(0.453 3 U/mg)和低剂量组 W-AAPs(0.419 9 U/mg)提高了12.29%与21.22%(P<0.05)],与空白组无显著差异,表明高剂量和低剂量组的F-AAPs的SOD活性几乎完全恢复到正常水平。这表明F-AAPs在清除超氧阴离子自由基方面能力非常突出。在GSH-Px指标上,F-AAPs与W-AAPs同样显示出一定的恢复趋势,但与模型组比较差异不显著(P>0.05)。

炎症反应在UC发病机制中起着关键作用[18]。抑制促炎细胞因子(IL-6和TNF-α等)的分泌,有助于缓解氧化应激并控制疾病进展[19]。图6(d)中,模型组TNF-α含量显著高于空白组,表明DSS触发大量TNF-α释放,加剧了UC的炎症反应。MES组TNF-α含量显著低于模型组(P<0.05),说明MES有效降低了TNF-α含量。与模型组比较,W-AAPs-H与F-AAPs-L不能显著降低TNF-α含量,W-AAPs-L与F-AAPs-H均能显著降低TNF-α含量(P<0.05)。其中F-AAPs-H(472.17 ng/L)效果显著优于高剂量和低剂量组的W-AAPs、F-AAPs-L及MES组,且与W-AAPs-H(777.85 ng/L)比较TNF-α含量下降了39.30%。图6(e)中,模型组IL-6含量显著高于空白组(P<0.05),表明DSS破坏肠黏膜屏障,导致IL-6大量分泌。与模型组相比,2种AAPs干预下均能显著降低IL-6含量(P<0.05)。

W-AAPs与F-AAPs在缓解UC中表现出不同作用模式。F-AAPs-H在抑制全身与局部炎症及提升抗氧化能力方面优于W-AAPs,这与其对小鼠整体临床症状(体重减轻和疾病活动指数评分等)更为显著的改善作用相一致。与之相比,W-AAPs则显示出在肠道屏障修复方面的特定优势。W-AAPs的直接抗炎和抗氧化能力相对弱,但在修复肠道屏障,使LPS水平恢复正常方面效果较好,可快速修复物理屏障,减少毒素入血。

2.3 2种AAPs对UC小鼠肠道菌群影响

2.3.1 基于Alpha和Beta多样性分析比较小鼠肠道菌群结构差异

肠道菌群深度参与人体免疫、代谢以及消化吸收等多种生理过程。天然多糖难以被宿主直接吸收,首要作用靶点是肠道菌群,可通过调节菌群丰度预防UC小鼠肠道菌群失衡[20]。

采用Bray-Curtis相异系数并结合相似性分析,对2种AAPs对UC小鼠肠道菌群的影响进行统计,结果见图7。图7表明,不同组间差异显著(P=0.002),说明2种AAPs干预后显著改变了UC小鼠肠道菌群结构。非度量多维尺度分析表明,应力值为0.1,表明排序结果具有较好的可靠性,确保能准确反映样本间肠道菌群组成的相似性与差异性。图7(a)中,PC1和PC2的累计贡献度超过60%,说明实验数据可信度非常高。模型组样本点与空白组能分离,直观表明DSS成功诱导了肠道菌群失调。空白组与F-AAPs-H组高度重合,说明二者的优势菌门/菌属组成和比例非常接近,与其他组别能被区分,表明F-AAPs-H干预可能使菌群恢复至接近正常状态。Shannon指数可衡量菌群α多样性指标,反映样本内物种的丰富度和均匀度,数值越高表示物种越多、分布越均匀,菌群健康;数值越低表示物种减少、某些菌占主导。图7(b)中,空白组、模型组、MES组、高剂量和低剂量组的F-AAPs与高剂量和低剂量组的W-AAPs的Shannon指数分别为5.31、5.01、4.60、4.55、5.74、4.91与5.72。与模型组比较,高剂量的2种AAPs明显提高了Shannon指数,甚至高于空白组;而低剂量的2种AAPs的Shannon指数均低于模型组。说明高剂量的2种AAPs能提高肠道菌群的丰富度和均匀度,促进菌群结构恢复,表明其对肠道微生态失衡具有较好的改善作用。

图7 2种AAPs对UC小鼠肠道菌群影响的统计分析

Fig.7 Statistical analysis of the effects of two AAPs on gut microbiota in UC colitis mice

2.3.2 基于门和属水平的小鼠肠道菌群组成差异性分析

对小鼠肠道菌群的16S rRNA测序数据进行统计分析,结果见图8。由图8可知,各组小鼠中Firmicutes(厚壁菌)与Bacteroidota(拟杆菌)均为小鼠肠道内优势菌门。厚壁菌与拟杆菌比例(F/B)对于维持肠道健康非常重要,该比值变化一般与菌群失衡相关,并可能与多种疾病有关[21]。模型组F/B值(2.414)高于空白组(1.828),伴随着厚壁菌门和拟杆菌门丰度的同步降低,这并非单一的菌门比例变化,而是整体菌群丰度下降背景下的相对改变,表明疾病状态引发了肠道菌群失调。MES组的F/B值进一步升高至4.631,这可能意味着肠道菌群发生了结构与功能上的重塑,具体表现为拟杆菌门丰度降低,而变形菌门、疣微菌门等丰度增加。与此同时,关键有益菌如Akkermansia(阿克曼菌)的丰度显著上升。该菌以分解并再生肠道黏液层中的黏蛋白而著称,对维持肠道屏障完整性具有重要作用。这反映了MES组的F/B值升高不是单纯的菌群失调,而是药物干预引导下,菌群组成向促进屏障修复、增强黏膜保护的功能状态转变。这一转变有助于缓解肠道炎症,这与前文中MES组炎症因子水平降低相呼应。高剂量和低剂量组的F-AAPs与高剂量和低剂量组的W-AAPs的F/B值分别为3.973、1.948、2.172与1.675,除F-AAPs-H接近MES组,其他组数据均比模型组低,表明F-AAPs-H与其他样品的作用方式不同,其干预使F/B值向MES组方向变化。

图8 2种AAPs对UC小鼠肠道菌群的影响

Fig.8 Effects of two AAPs on gut microbiota in UC colitis mice

门水平显示F-AAPs-H组的Proteobacteria与Desullobacteria较高,但Campylobacterota明显降低。属水平最突出的信号是Akkermansia被F-AAPs-H强烈抑制,同时强致病菌Escherichia-Shigella明显减少,表明F-AAPs-H不是简单地抑菌或促菌,可能是引导菌群从一种炎症状态向另一种更具恢复力的状态转型。F-AAPs-L则显著降低了Proteobacteria和Desullobacteria丰度,几乎完全清除了Escherichia-Shigella,而Akkermansia明显增加。这可能是剂量差异导致肠道细菌利用方式的改变,F-AAPs-L抑制了某些致病菌,同时增殖了益生菌Akkermansia;而F-AAPs-H则通过高浓度改变代谢环境,抑制了Akkermansia并促进其他有益菌的竞争。高剂量和低剂量组的W-AAPs与F-AAPs-L类似,均是在门水平上,显著降低了Proteobacteria和Desullobacteria丰度,属水平上抑制了Escherichia-Shigella的生长,促进了Akkermansia的生长。

2.3.3 基于LEfSe比较分组间肠道菌群的差异

采用对数LDA(影响力强度评分)截止值≥3.0的线性判别分析效应(LEFSe)建模,对小鼠肠道菌群进行分析,获得组间统计和分类差异,结果见图9。图9(a)中圆圈大小与该分类单元的LDA值成正比。圆圈越大,代表肠道菌区分组间的判别能力越强,影响力越大。F-AAPs-H对g_Desulfovibrio(硫酸盐还原菌,SRB)的影响从属到门都是大圆圈,表明其对SRB产生整体促进作用。推测是由于F-AAPs-H发酵产生了大量氢气,为SRB群落提供了充足的营养基底,而SRB又将硫酸盐还原为硫化氢(H2S),破坏肠道屏障。这与图6中F-AAPs-H对LPS水平降低效果弱于W-AAPs-L是一致的。F-AAPs-H对于产丁酸肠道菌如g_Fusicatenibacter与g_Agathobacter的影响只反映在属与种水平,表明其作用机制是复杂且双向的,一方面特异性地富集关键的产丁酸有益菌属;同时又通过产生H2滋养了SRB支系。图9(b)中空白组富集了Muribaculaceae等健康小鼠肠道中最主要菌群,代表了健康的基线状态。MES组富集了Akkermansia等有益菌。模型组主要富集了g_Eubacterium,其丰度变化与肥胖、结直肠癌等疾病相关。F-AAPs-H组主要富集g_Fusicatenibacter与g_Agathobacter,二者均是被广泛报道的有益菌属,与丁酸盐产生、抗炎效应正相关。可见,F-AAPs-H与MES组药物作用途径不同,F-AAPs-H通过提升Fusicatenibacter等起效,而MES组主要通过提升Akkermansia起效。F-AAPs-H组的F/B值介于模型组和MES组之间,且其富集的有益菌与健康基线(空白组)的菌群(Muribaculaceae)也不同。这表明F-AAPs-H组的F/B比值是由有益厚壁菌(产丁酸盐菌)和有害厚壁菌(SRB)共同推高的,反映了菌群结构的重塑,并非单纯抑制有害菌,而是引导UC小鼠肠道菌群走向新的有益稳态,进而与宿主的抗氧化、抗炎系统产生协同,最终缓解小鼠UC。

图9 F-AAPs-H与3个对照组肠道菌群的LEfSe差异

Fig.9 LEfSe analysis of gut microbiota between F-AAPs-H group and three control groups

在抗UC的多项评价指标中,F-AAPs的效果均明显优于W-AAPs。这种差异可能主要与两者分子结构和分子质量的差异相关,从而影响了其活性基团的暴露程度和生物活性表现。F-AAPs呈现疏松的网状结构,其内部的绳捆状排列使得多糖链上的生物活性位点(特定官能团、带电位点等)充分暴露。这种结构有利于体内酶系统和肠道微生物深入多糖网络内部,并与多糖发生有效相互作用。此外,F-AAPs作为益生菌缓慢释放的食物,能够持续提供底物支持肠道菌群的生长和代谢,从而对维持肠道屏障功能和肠道微生态平衡发挥重要作用。

W-AAPs表现为致密的片层堆积结构,其厚重的片层导致多糖链紧密排列,使得活性位点被深埋在内部,形成物理屏障,阻碍酶、受体或微生物的接近和识别。这种结构不仅降低了多糖与肠道微生物的相互作用效率,还限制了其被菌群分泌的酶降解,降低了其潜在的生物活性。由此可见,F-AAPs和W-AAPs在微观形态上的差异,与其在小鼠UC模型中表现出的抗炎、抗氧化及肠道保护能力具有高度一致性,揭示了结构特征对功能发挥的重要影响。

从分子质量角度分析,F-AAPs的分子质量显著低于W-AAPs,这一差异主要源于提取方法的不同。在H2O2提取过程中,H2O2在加热条件下分解产生活性氧,能够氧化破坏黑木耳细胞壁,使其结构松散,从而促进多糖溶出。然而,由于反应相对缓慢,细胞壁的降解有限,因此获得的W-AAPs仍具有较高分子量。Vc-H2O2复合提取法能够持续生成高活性的羟基自由基(·OH),这种自由基几乎无选择性地攻击生物大分子,高效破坏细胞壁结构,显著提高多糖提取效率;同时,·OH对多糖链本身也会产生降解作用,使其分子质量进一步降低,并可能通过氧化作用破坏链内及链间相互作用,打破原有紧密聚集态,形成疏松网状结构。F-AAPs在多项抗UC指标上优于W-AAPs,可以推测其优越性主要与分子质量下降、活性位点暴露增加以及结构疏松化有关。希望这一结构与功能的关系可为多糖在肠道疾病防治中的应用提供理论依据,为多糖提取及改性工艺优化提供参考。

3 结 论

本研究表明,F-AAPs与W-AAPs的分子结构和分子质量均存在显著差异。F-AAPs呈疏松的网状结构,分子质量较低,使多糖链上的活性位点充分暴露;而W-AAPs呈致密片层堆积结构,活性位点被埋藏在内部,限制了其与酶、受体及肠道菌群的相互作用。结构差异直接影响了2种多糖的生物功能。功能评价显示,F-AAPs在改善UC小鼠的肠道通透性、抗氧化和抗炎方面均优于W-AAPs,其疏松结构有助于益生菌持续利用多糖并增强肠道屏障功能。低分子质量与活性位点暴露的特点可能是F-AAPs具有较佳的抗UC活性的主要原因。此外,F-AAPs的作用与短链脂肪酸产生菌(g_Fusicatenibacter与 g_Agathobacter 等)丰度增加呈正相关,提示其对肠道微生态调节具有潜在贡献。尽管本研究揭示了 F-AAPs 结构与功能的关联,但仍存在局限性,如对黑木耳多糖精细化学结构和官能团变化尚未完全解析。未来研究可结合甲基化分析、核磁共振等手段,进一步明确自由基介导提取对多糖分子结构及构效关系的影响。本研究证实F-AAPs在UC干预中具有一定的生物活性,希望为食药用菌多糖的机制研究和功能食品开发提供理论依据。

参考文献：

[1] 李孔会, 廖森泰, 李倩, 等. 山药多酚对结肠炎小鼠肠黏膜损伤预防作用研究[J].食品科学技术学报,2021,39(4):46-54.LI K H, LIAO S T, LI Q, et al.Study on preventive effect of chinese yam peel polyphenols on intestinal mucosal injury in colitis mice[J].Journal of Food Science and Technology, 2021,39(4):46-54.

[2] XIONG H, BAI S S, HUI O Y, et al. Structural characterization and medium-chain acyl-coenzyme a dehydroge-nase-mediated anti-inflammatory mechanism of a Hulless barley Monascus polysaccharide in ulcerative colitis[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2025, 330 (Part 3): 148033.

[3] WU J W, LI P, TAO D B, et al. Effect of solution plasma process with hydrogen peroxide on the degradation and antioxidant activity of polysaccharide from Auricularia auricula[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2018, 117: 1299-1304.

[4] CASSONE A. Development of vaccines for Candida albicans: fighting a skilled transformer[J]. Nature Reviews Microbiology, 2013, 11: 884-891.

[5] 孔志强,赵玉红.沙棘降解多糖结构表征和功能特性研究[J].食品科学技术学报,2023,41(6):65-74.KONG Z Q, ZHAO Y H. Structural characterization and functional properties of sea buckthorn degraded polysaccharides[J]. Journal of Food Science and Technology, 2023,41(6):65-74.

[6] 耿乙文, 哈益明, 靳婧, 等. 过氧化氢改性苹果渣膳食纤维的研究[J]. 中国农业科学, 2015, 48(19): 10-15.GENG Y W, HA Y M, JIN J, et al. Apple pomace die-tary fiber by modified hydrogen peroxide[J]. Chinese Journal of Agricultural Sciences, 2015, 48(19): 10-15.

[7] CHEN X Y, SUN-WATERHOUSE D X, YAO W Z, et al. Free radical-mediated degradation of polysaccharides: mechanism of free radical formation and degradation, influence factors and product properties[J]. Food Chemistry, 2021, 365: 130524.

[8] CHEN X Y, WANG H J, LIU Y Q, et al. Anti-inflammatory effect of lamivudine on ulcerative colitis[J]. Biochemistry and Biophysics Reports, 2025, 44: 102317.

[9] 黄智鹏. 母婴源罗伊氏乳杆菌和短双歧杆菌对DSS诱导的小鼠结肠炎症状的影响及其机制研究[D]. 广州: 南方医科大学, 2024.HUANG Z P. Effects of Limosilactobacillus reuteri and Bifidobacterium breve isolated from mother and infant on DSS-Induced colitis in mice and their mechanisms[D]. Guangzhou: Southern Medical University,2024.

[10] YAO J, ZENG J Y, TANG H N, et al.Preparation of Auricularia auricula polysaccharides and their protective effect on acute oxidative stress injury of Caenorhabditis elegans[J].International Journal of Biological Macromolecules,2023,8:253.

[11] ZHOU C S, YU X J, ZHANG Y Z, et al. Ultrasonic degradation, purification and analysis of structure and antioxidant activity of polysaccharide from Porphyra yezoensis Udea[J]. Carbohydrate Polymers, 2012, 87(3): 2046-2051.

[12] LI B, DU P L, DU Y, et al. Luteolin alleviates inflammation and modulates gut microbiota in ulcerative colitis rats[J]. Life Sciences, 2021, 269: 119008.

[13] HUANG R B, CAI Y B,WANG X H, et al. Passiflora edulis leaves polysaccharides mitigate DSS-induced ulcerative colitis in mice via inflammation inhibition and gut microbiota modulation[J]. Journal of Functional Foods, 2025, 129: 106891.

[14] FANG X Y, LIU H Y, DU Y Q, et al. Bacillus siamensis targeted screening from highly colitis-resistant pigs can alleviate ulcerative colitis in mice[J]. Research (Washington D C), 2024, 7: 0415.

[15] ZHAO X, FU H Y, QIU S N, et al. Effects of early protein restriction on the growth performance and gut development of pigs fed diets with or without antibiotic[J]. Animal, 2020, 14(7): 1392-1401.

[16] XIANG X W, ZHOU X L, WANG R, et al. Protective effect of tuna bioactive peptide on dextran sulfate sodium-induced colitis in mice[J]. Marine Drugs, 2021, 19: 127.

[17] XU W M, HUA Z B, WANG Y S, et al. Redox-induced stabilization of AMBRA1 by USP7 promotes intestinal oxidative stress and colitis through antagonizing DUB3-Mediated NRF2 deubiquitination[J]. Advanced Science, 2025, 12(12): 2411320.

[18] CHEN B, LUO J K, HAN Y H, et al. Dietary tangeretin alleviated dextran sulfate sodium-induced colitis in mice via inhibiting inflammatory response, restoring intestinal barrier function, and modulating gut microbiota[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2021, 69(27): 7663-7674.

[19] MO C Y, LIU R F, YANG Z H, et al. Polysaccharide from Pleurotus tuber-regium mycelium improves DSS-induced colitis in mice by regulating inflammatory cytokines, oxidative stress and gut microbiota[J]. Food &Function, 2024, 15(7): 3731-3743.

[20] MA G X, HU Q H, HAN Y H, et al. Inhibitory effects of β-type glycosidic polysaccharide from Pleurotus eryngii on dextran sodium sulfate-induced colitis in mice[J]. Food &Function, 2021, 12(9): 3831-3841.

[21] 唐婷. 地黄多糖的提取、纯化、结构表征及生物活性[D]. 贵州: 贵州师范大学, 2023.TANG T.Extraction, purification, structural characteri-zation and bioactivity of polysaccharides from Rehmannia glutinosa Libosch[D]. Guizhou: Guizhou Normal University, 2023.

Effect of Extraction Methods on Microstructure and Anti-Ulcerative Colitis Activity of Auricularia auricula Polysaccharides

YAO Qiqi, TANG Yuxuan, LI Shirong, CAI Jiali, XIANG Can, ZHAO Hongcheng,OU Shiyi, YANG Lingli, ZHANG Yongjun*, ZHU Liyun*

(College of Life Sciences, China Jiliang University, Hangzhou 310018, China)

Abstract： To compare the effects of two radical-based extraction methods on the microstructure of Auricularia auricula polysaccharides (AAPs) and their therapeutic potential against ulcerative colitis (UC), polysaccharides were extracted using hydrogen peroxide (W-AAPs) and ascorbic acid-hydrogen peroxide (F-AAPs) methods, and their molecular weights and microstructural features were characterized. Subsequently, a dextran sulfate sodium-induced mouse model of UC was established. Mice were divided into a control group, model group, mesalazine group, and high- and low-dose W-AAPs and F-AAPs groups to evaluate the effects of polysaccharides on disease activity index, colonic histopathology, oxidative stress, inflammatory cytokines, and gut microbiota composition. The results showed that F-AAPs had a molecular weight of 87.646 kDa, significantly lower than that of W-AAPs (301.89 kDa). The microstructure of F-AAPs exhibited a loose rope-like network favorable for sustained utilization by beneficial gut bacteria, whereas W-AAPs formed dense lamellar structures. Compared with the model group, both 2 AAPs alleviated UC symptoms, increased serum superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase activities, decreased serum lipopolysaccharide levels, and suppressed TNF-α and IL-6 expression (P<0.05). Notably, compared with the same dose of W-AAPs, high-dose F-AAPs group exhibited superior antioxidant activity (SOD activity increased by 12.29%, P<0.05) and more pronounced anti-inflammatory effects (TNF-α decreased by 39.30%, P<0.05), which were positively correlated with the abundance of short-chain fatty acid-producing bacteria such as g_Fusicatenibacter and g_Agathobacter in the gut microbiota, particularly butyrate producers. In summary, the unique microstructure and lower molecular weight of F-AAPs contributed to its superior bioactivity in UC intervention compared with W-AAPs. These findings provided a theoretical basis for the functional development of AAPs and their potential applications in functional foods.

Keywords： Auricularia auricula polysaccharide; free radical-mediated; ulcerative colitis; gut microbiota; molecular weight; micro-morphology

doi：10.12301/spxb202500576

文章编号：2095-6002(2026)03-0138-13

引用格式：姚琦琪, 汤雨萱, 李世蓉, 等. 提取方式对黑木耳多糖微观结构及其抗溃疡性结肠炎活性的影响[J]. 食品科学技术学报,2026,44(3):138-150.

YAO Qiqi, TANG Yuxuan, LI Shirong, et al. Effect of extraction methods on microstructure and anti-ulcerative colitis activity of Auricularia auricula polysaccharides[J]. Journal of Food Science and Technology, 2026,44(3):138-150.

中图分类号： TS201.4

文献标志码： A

收稿日期： 2025-12-02

基金项目： 国家自然科学基金资助项目(31871797); 浙江省“三农九方”科技协作计划项目(2025SNJF038)。

Foundation: National Natural Science Foundation of China(31871797); Zhejiang “Three Rural Issues and Nine Aspects” Science and Technology Collaboration Program(2025SNJF038).

第一作者：姚琦琪, 女, 硕士研究生, 研究方向为多糖结构与功能;

共同第一作者： 汤雨萱, 女,硕士研究生, 研究方向为黑木耳多糖的生物活性机制。

*通信作者： 张拥军, 女,教授,主要从事多糖生物功能的结构基础方面的研究;朱丽云, 女,教授,主要从事植物源天然活性成分的提取及其功能解析方面的研究。

(责任编辑：叶红波)