运动引起的疲劳主要表现为机体在剧烈或长时间运动后出现的运动能力下降,通常可分为外周性疲劳和中枢性疲劳[1]。目前认为,外周性疲劳主要与能量耗竭、代谢产物积累、氧化应激和炎症反应相关。高强度运动可导致糖原耗竭、尿素氮(BUN)和肌酸激酶(CK)水平升高,并伴随活性氧(ROS)过量产生和促炎因子释放,从而造成肌肉损伤与功能下降。中枢性疲劳则与神经递质平衡紊乱、神经冲动传导受限及运动驱动力减弱密切相关。例如,长时间运动后可出现5-羟色胺升高、多巴胺活性下降以及下丘脑-垂体-肾上腺轴功能异常[2]。长期高强度运动会对多器官和组织造成严重负荷,进而显著降低工作效率和运动表现,尤其对运动员等群体影响突出[3]。食源性天然产物及其活性成分是抗疲劳功能成分的主要来源[4-6]。

近年来,肠道菌群在运动疲劳中的变化受到广泛关注。骨骼肌与肠道之间的相互作用被称为“肠-肌肉轴”,一些炎症反应、代谢及线粒体功能需求增加等因素可导致肠道屏障的稳态改变,从而促进蛋白质及其他营养物质的消化吸收,加快骨骼肌的能量代谢[7-8]。研究表明,运动疲劳可能破坏肠道稳态,增加肠道通透性并升高氧化应激水平,导致短链脂肪酸(SCFAs)减少及肌肉功能受损[9]。相应地,益生菌及一些功能性食物摄入可改善肠道菌群结构,从而提升运动耐力并减轻疲劳表现,这为抗疲劳研究提供了新的思路。

海参粗多肽(sea cucumber crude peptides, SCP)是从海参(Apostichopus japonicus)中提取蛋白并经过一定工艺处理后获得的多肽,具有显著的抗氧化和抗炎作用[10-11]。有研究表明,SCP通过电子或质子转移机制清除自由基[12]。同时,SCP还可通过抑制NF-κB和MAPK等信号通路减轻炎症反应[13]。由于运动疲劳产生机制涉及ROS积累和炎症反应增加,我们推测SCP可能对运动疲劳具有缓解作用。与此同时,运动疲劳常伴随肠道炎症及屏障功能受损。已有研究表明,海地瓜来源海参肽在2型糖尿病大鼠模型中,以及橙足海参肽在溃疡性结肠炎小鼠模型中,均具有调节肠道菌群结构的作用[14-15],而关于SCP是否能够通过调节肠道菌群发挥抗疲劳作用,目前研究较少。本团队前期研究发现,海参粗多肽可显著提高衰老动物上肢悬挂力量,延缓衰老小鼠肌肉减少[16]。为了进一步了解其作用机制,本研究分析SCP的抗疲劳效应与调节肠道炎症、维持肠道屏障完整性的关系。SCP以组合酶水解联合超声辅助处理的方法制备,拟通过小鼠负重游泳实验评价海参粗多肽的抗疲劳作用。通过行为学测试、生化指标检测、肠道菌群16S rRNA测序和实时荧光定量PCR(RT-qPCR方法),评估SCP对小鼠运动疲劳的改善作用,并探讨其作用机制,希望为海参粗多肽用于缓解运动疲劳及相关功能食品的开发提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

活海参(Apostichopus japonicus),购自广州市黄沙海鲜市场;胰蛋白酶,湖南中辰生物科技有限公司;复合蛋白酶、木瓜蛋白酶,河南万邦华工科技有限公司;β-烟酰胺单核苷酸(纯度≥ 99%),上海麦克林生化科技有限公司;牛血清白蛋白(纯度≥99%),广州瑞舒生物科技有限公司;丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、肌酐(CRE)、肌酸激酶(CK)、尿素(Urea)试剂盒,江苏艾迪生生物科技有限公司;白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、睾酮(Testosterone)、皮质醇(Cortisol)试剂盒,江苏酶免生物科技有限公司;肝/肌糖原测定试剂盒(比色法),南京建成生物科技有限公司;苏木素伊红(H&E)染色试剂盒,北京索莱宝生物科技有限公司;AIN-93M鼠粮,戴茨生物科技有限公司;TRIzol,赛默飞世尔科技公司;All-in-one First Strand cDNA Synthesis Kit Ⅱ(with dsDNase)、2×SYBR Green qPCR MasterMixⅡ,赛文创新生物科技有限公司;舒泰-50,法国维克有限公司;AccQ Tag化学试剂包,沃特世公司;氨基酸混标,中国科学计量院。

1.2 仪器与设备

RM1726型石蜡包埋机、RM2255型石蜡切片机,德国Leica公司;75005453型台式冷冻高速离心机、QuantStudio 6 Pro型实时荧光定量PCR仪,赛默飞世尔科技公司;KW-ZL-2型大小鼠握力测试系统,南京卡尔文生物科技有限公司;DW-HL388型超低温冰箱,中科美菱低温科技股份有限公司;HWS-24型电热恒温水浴锅,上海一恒科学仪器有限公司;XR-6C/6D型小鼠转棒疲劳仪,上海欣软信息科技有限公司;YP6002B型电子天平,力辰仪器科技有限公司;BSA224S-CW型分析天平,德国赛多利斯集团;KQ5200E型超声波清洗器,昆山市超声仪器有限公司;CKX31型普通光学倒置显微镜,日本奥林巴斯株式会社;UV-5500PC型紫外可见分光光度计,上海元析仪器有限公司;2695型高效液相色谱仪、2996型紫外检测器,沃特世公司。

1.3 实验方法

1.3.1 SCP的制备

活海参蛋白质提取方法以文献[17]为基础,并进行了适当修改。为考察不同酶组合对海参酶解的影响,设计了3组实验:复合蛋白酶与胰蛋白酶组、复合蛋白酶与木瓜蛋白酶组、胰蛋白酶与木瓜蛋白酶组。去除海参内脏后,各组分别称取0.1 g海参组织,经胶体磨进行充分研磨。加入蒸馏水至10 mL,所得海参浆液于100 ℃加热10 min后冷却至室温。加入对应组合的两种酶(每种酶各0.01 g),于53 ℃水浴条件下酶解5 h。酶解结束后,煮沸10 min以灭活酶的活性,随后以3 000 r/min转速离心20 min。

1.3.2 多肽含量的测定

1)试剂配制。称取Na2CO3 10 g、NaOH 2 g和KNaC4H4O6·4H2O 0.25 g,溶解于500 mL蒸馏水中,配制成福林酚甲A液。另取CuSO4·5H2O 0.5 g,溶解于100 mL蒸馏水中,配制成福林酚甲B液。使用时,按体积比50∶1将福林酚甲A液与福林酚甲B液混合,配制成福林酚甲工作液。同时,将原始福林酚试剂与蒸馏水按1∶1的体积比稀释,制备成福林酚乙液。

2)蛋白浓度标准曲线绘制。取6支洁净试管,分别加入250 μg/mL牛血清白蛋白(BSA)标准溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,各管均用去离子水定容至1.0 mL。另取1支洁净试管加入1 mL蒸馏水作为空白对照。向各标准管和空白管中分别加入5.0 mL新配制的福林酚甲工作液,涡旋混匀后于30 ℃恒温反应10 min。再加入0.5 mL福林酚乙液,充分混匀后继续于30 ℃避光反应30 min。以零浓度管为空白对照,使用1 cm石英比色皿,在650 nm波长处采用紫外分光光度计测定各管吸光值,绘制标准曲线。

3)SCP提取率测定。将酶解液以3 000 r/min离心20 min,取上清液备用。吸取1 mL上清液置于离心管中,加入4 mL超纯水稀释后,再加入5.0 mL体积分数为10%的三氯乙酸(TCA)溶液,充分混匀后以3 000 r/min离心40 min,取上清液并适当稀释。取500 μL稀释后的样品,与等体积超纯水混合,混匀后加入5.0 mL福林酚甲工作液,于30 ℃反应10 min后,加入0.5 mL福林酚乙液,迅速混匀后于30 ℃避光反应30 min。设置不含蛋白的空白对照,在650 nm波长处采用紫外分光光度计测定样品吸光度。SCP提取率计算方法见式(1)。

SCP提取率

(1)

式(1)中,X为由标准曲线中计算出相对应的蛋白质量,μg;n为稀释倍数;m为样品质量,g。

1.3.3 提取条件的优化

1.3.3.1 海参添加量的确定

称取0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 g海参,分别加入蒸馏水至10 mL,制成海参浆。将海参浆加热至100 ℃,保温10 min,冷却后加入木瓜蛋白酶和胰蛋白酶各0.01 g,置于53 ℃水浴锅内酶解5 h。反应结束后,煮沸10 min灭酶,测定多肽提取率。

1.3.3.2 酶解时间的确定

称取0.1 g海参,过胶体磨磨细,加入蒸馏水至10 mL,制成海参浆。将海参浆加热至100 ℃,保温10 min,冷却后加入木瓜蛋白酶和胰蛋白酶各0.01 g,置于水浴锅内53 ℃酶解6 h,分别在酶解2、3、4、5、6 h取样。各时间点样品取出后立即煮沸10 min灭酶,测定多肽提取率。

1.3.3.3 超声时间的确定

按1.3.3.2中的方法进行海参浆酶解处理,在酶解反应进行至4 h时取样。将样品分为若干份,分别超声10、20、30、40、50 min。各超声结束后立即煮沸10 min灭酶,测定多肽提取率。根据海参添加量、酶解时间和超声时间的优化结果,称取200 g海参制备粗多肽样品,用于后续氨基酸组成测定及动物实验。

1.3.4 SCP氨基酸组成的测定

1)氨基酸标准品检测。取25 μL氨基酸混合标准液,加入75 μL纯水,涡旋混匀。取10 μL稀释后的氨基酸混合标准液注入衍生管中,加入70 μL硼酸缓冲液,涡旋混合,再加入20 μL AccQ.Tag衍生剂,立即涡旋混合,室温放置1 min,封闭衍生管,于55 ℃烘箱中加热10 min,转入进样瓶中,进行高效液相色谱分析。色谱柱为AccQ.TagTM氨基酸分析专用柱,柱温37 ℃,流速1.0 mL/min,进样量10 μL,检测波长248 nm。流动相A为乙酸钠缓冲液,流动相B为水,流动相C为乙腈。采用梯度洗脱。

2)样品检测。称取SCP样品1.4 mg,加入1 mL纯水溶解,再加入1 mL盐酸,使盐酸终浓度为6 mol/L,在110 ℃条件下酸水解23 h。取1 mL水解液抽干,用1 mL 0.02 mol/L盐酸复溶。取10 μL复溶液注入衍生管中,加入70 μL硼酸缓冲液,涡旋混合;再加入20 μL AccQ.Tag衍生剂,立即涡旋混合,室温放置1 min。随后封闭衍生管,于55 ℃烘箱中加热10 min,转入进样瓶进行高效液相色谱分析。样品检测的色谱参数与氨基酸标准品检测所用参数一致。各氨基酸相对浓度通过样品峰面积与同种氨基酸标准品峰面积的比值乘以对应标准品浓度计算;氨基酸组成占比为某一氨基酸相对浓度占所有检测氨基酸相对浓度总和的百分比。

1.3.5 动物实验设计

C57BL/6J雄性小鼠(6周龄),购自广东省实验动物中心。实验动物使用许可证号:SYXK(粤)2022-0125,实验动物生产许可证号:SCXK(粤)2022-0002。实验方案经广东药科大学实验动物伦理委员会批准(伦理审批编号:gdpulacspf 2022601),所有动物实验均严格遵循相关伦理指南。小鼠饲养于SPF级环境,温度控制在(22±2)℃,小鼠自由摄取AIN-93M鼠粮及饮水。

1.3.5.1 小鼠负重游泳实验

适应性饲养3 d后,将小鼠置于深度30 cm、温度(25±2)℃的水箱中进行游泳适应性训练。实验开始前连续3 d,每天进行20 min无负重游泳,随后进行负重游泳训练。根据力竭游泳时间及体重情况将小鼠分为4组,每组8只。正常组(Control组)灌胃生理盐水,运动疲劳组(EF组)灌胃生理盐水,SCP组灌胃150 mg/kg SCP,β-烟酰胺单核苷酸组(NMN组)灌胃20 mg/kg NMN。本研究所采用的SCP剂量为150 mg/kg,参考了海参多肽动物补充的研究[18]。在人体临床研究中,NMN口服剂量为100～2 000 mg/d,其中250 mg/d为最常用剂量[19]。已有研究表明,在健康老年男性中长期口服补充NMN(250 mg/d)可改善肌肉功能[20],并在之前预实验中发现20 mg/kg NMN可改善衰老小鼠肌肉功能。干预物质均以生理盐水为溶剂,每日灌胃一次,在连续灌胃1周后,进行力竭游泳实验,持续时间为8周。实验方法:在小鼠尾部绑上相当于体重8%的铅皮,将其置于30 cm深水箱中计时。当小鼠无法保持正常游泳姿势,口鼻沉入水中且5 s内未能浮出时,判定为力竭,立即捞出并记录力竭时间。Control组不进行游泳训练,其余各组均进行负重游泳实验。负重游泳实验期间每周记录小鼠体重情况。

1.3.5.2 小鼠握力实验和转棒实验

1)握力实验。将小鼠四肢置于90 mm×90 mm网格中自然抓握,随后轻轻拉动小鼠尾部,直至小鼠松开网格,采用数字式握力系统自动记录最大握力值。

2)转棒实验。将小鼠放置于转棒上,转棒在1 min内由静止匀加速至4 r/min,以使小鼠适应。将转棒加速度设为10 r/min,直至达到25 r/min,采用小鼠转棒疲劳系统记录小鼠从转棒上掉落时间。

1.3.5.3 小鼠旷场实验和高架十字迷宫实验

1)旷场实验。将小鼠放置于50 cm×50 cm的方形旷场中央,使用Ethovision XT 11.5系统对小鼠的运动轨迹和活动数据进行数字化记录,记录时间为5 min。实验过程中保持环境安静,每次实验结束后清除小鼠粪便及气味。

2)高架十字迷宫实验。将小鼠置于开放臂与闭臂的交叉中央区域,使用Ethovision XT 11.5系统记录小鼠运动轨迹和活动数据,记录时间为3 min。实验全程保持安静,每次实验结束后清理小鼠粪便和气味。

1.3.6 生化指标检测

向小鼠肌肉注射舒泰-50(盐酸替来他明-盐酸唑拉西泮,Zoletil® 50,50 mg/kg),麻醉后,通过眶后静脉窦采集血液,在4 ℃条件下,以3 200 r/min转速离心15 min,收集上清液并储存于-80 ℃环境中。血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、肌酸激酶(CK)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、睾酮(testosterone)及皮质醇(cortisol)水平均按照ELISA试剂盒说明书检测。使用糖原检测试剂盒测定股四头肌及肝脏组织糖原水平,并根据光密度(OD)值计算糖原水平。

1.3.7 石蜡切片制备与染色

取小鼠腓肠肌,置于质量分数为4%的多聚甲醛溶液固定,固定后的组织经梯度乙醇脱水及二甲苯透明处理,进行石蜡包埋。制备厚度为4 μm的切片,并进行苏木精-伊红染色(H&E),采用显微镜成像系统观察并拍摄图像。

1.3.8 RNA提取和RT-qPCR分析

取约100 mg腓肠肌,加入1 mL TRIzol试剂充分匀浆,室温静置5 min后加入200 μL氯仿,剧烈振荡15 s,再于室温静置3 min。在4 ℃条件下,以12 000 r/min转速离心15 min,将上层水相转移至新的1.5 mL离心管中。加入500 μL异丙醇轻轻混匀,室温静置10 min后,于4 ℃条件下,以12 000 r/min转速离心10 min。弃上清液,保留RNA沉淀。使用75%乙醇清洗沉淀,短暂离心后弃上清液,室温条件下干燥约5 min。以30 μL无酶水溶解RNA,并测定其浓度和纯度。

将RNA反转录为cDNA后,采用SYBR Green法进行RT-qPCR,检测目标基因的表达水平。以β-actin作为内参基因。RT-qPCR所用引物由广州艾基生物技术有限公司合成,具体序列见表1。相对基因表达量采用2(-ΔΔCt)方法计算。

1.3.9 肠道微生物群分析

收集小鼠粪便样品后立即置于-80 ℃环境中保存,并送至广州基迪奥生物科技有限公司进行粪便微生物测序。对粪便样品进行总DNA提取并检测其质量,构建测序文库,采用Illumina NovaSeq 6000平台进行测序。基于16S rRNA基因测序对各组小鼠肠道菌群的物种多样性、群落组成及差异丰度进行分析。生物信息学分析在Omicsmart在线数据分析平台完成(http:∥www.omicsmart.com)。

1.4 数据处理

采用GraphPad Prism 8软件进行数据分析,结果以平均值±标准差表示,利用Shapiro-Wilk检验评估数据是否符合正态分布。对于符合正态分布的数据,采用单因素方差分析(one-way ANOVA),并进行Tukey事后多重比较检验;对于不符合正态分布的数据,则采用nonparametric test中的Kruskal-Wallis检验。若P<0.05,则被认为具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 SCP提取率及氨基酸组成分析

2.1.1 SCP提取率分析

不同蛋白酶组合对多肽提取率的影响,实验结果如表2所示。由表2可知,木瓜蛋白酶和胰蛋白酶组合酶解后多肽提取率最高,因此选择该组合进行后续实验。

海参添加量、酶解时间及超声时间对多肽提取率的影响,实验结果见图1。由图1(a)可知,在组合酶添加量保持不变的条件下(木瓜蛋白酶和胰蛋白酶各0.01 g),随着海参添加量由0.05 g增加至0.10 g,多肽提取率由32.56%提高至36.14%,达到最高水平;当海参添加量进一步增加至0.20、0.40、0.80 g时,多肽提取率分别下降至21.84%、17.16%、11.90%。结果表明,0.10 g为后续实验的较佳海参添加量。由图1(b)可知,不同酶解时间下,酶解2、3、4、5、6 h时的多肽提取率分别为19.55%、24.42%、24.28%、29.15%、26.33%;酶解5 h条件下多肽提取率最高,因此确定较佳酶解时间为5 h。由图1(c)可知,不同超声时间下,超声10、20、30、40、50 min时的多肽提取率分别为22.16%、23.93%、26.33%、26.73%、25.99%。结果表明,超声40 min时多肽提取率最高,因此选定超声时间为40 min。

2.1.2 SCP氨基酸组成分析

高效液相色谱分析结果见图2,SCP的氨基酸组成见表3。由表3可知,SCP中共检测到17种氨基酸,其中甘氨酸(Gly)含量最高,为16.96%;其次为谷氨酸(Glu)、丙氨酸(Ala)和天冬氨酸(Asp),含量分别为13.87%、9.21%和8.85%。此外,脯氨酸(Pro)、精氨酸(Arg)和亮氨酸(Leu)含量也较高,分别为7.97%、7.70%和6.83%;而半胱氨酸(Cys)和蛋氨酸(Met)含量相对较低。

2.2 SCP对小鼠运动疲劳相关指标的影响

2.2.1 SCP对运动疲劳小鼠体重及器官质量的影响

为探讨运动疲劳对小鼠体重及器官质量的影响,采用持续8周的游泳力竭训练建立运动疲劳模型,实验结果见图3。由图3(a)可知,至第8周末时各组小鼠体重呈上升趋势,但EF组小鼠体重增加缓慢;与Control组相比,EF组体重下降2.73%。由图3(b)至图3(d)可知,各组小鼠肝脏、骨骼肌及脑质量均无显著差异。

2.2.2 SCP对运动疲劳小鼠运动耐力的影响

力竭时间被认为是评价运动耐力最直观且可靠的指标[21]。负重游泳、握力及转棒实验结果见图4。由图4(a)可知,与Control组相比,EF组小鼠游泳力竭时间显著下降43.9%;与EF组相比,SCP组和NMN组小鼠的游泳力竭时间分别显著增加66.5%和58.3%,其中SCP组的改善效果最为显著。

握力是评估肌肉力量和疲劳的重要指标[22]。由图4(b)可知,EF组小鼠握力较Control组显著下降37.7%,提示运动疲劳可能导致肌肉功能受损;与EF组相比,SCP组和NMN组小鼠的握力分别显著增加27.1%和46.2%,其中NMN组恢复效果最接近Control组水平。

转棒实验用于评估小鼠的运动协调性与平衡能力[23]。由图4(c)可知,EF组小鼠转棒停留时间较Control组显著缩短47.1%,提示运动疲劳可能导致运动协调性下降;与EF组相比,SCP和NMN干预均显著延长了小鼠的转棒停留时间,分别增加29.0%和35.3%。

2.2.3 SCP对运动疲劳小鼠焦虑样行为的影响

焦虑是运动员在疲劳状态下常见的负面情绪,可能会导致注意力下降、比赛信心减弱和训练消极等严重后果[24]。在中枢水平上,运动疲劳导致神经递质的动态变化,尤其是5-羟色胺和多巴胺的异常积累或消耗,从而影响情绪调节[25]。旷场实验和高架十字迷宫实验常用于评估小鼠焦虑样行为[26],实验结果见图5。

由图5(a)至图5(c)可知,在旷场实验中,EF组小鼠中心区域停留时间、中心区域运动路程以及总运动路程均较Control组显著降低;而SCP和NMN干预显著延长了中心区域的停留时间,但对中心区域运动路程及总运动路程无显著性差异。

由图5(d)至图5(f)可知,在高架十字迷宫实验中,与Control组相比,EF组小鼠开放臂进入次数占总进入次数的比例以及开放臂停留时间占总时间的比例显著下降,而闭臂路程占总路程的比例则显著升高;相比之下,SCP和NMN组处理显著提高了开放臂进入次数占总进入次数的比例和开放臂停留时间占总时间的比例,同时显著降低闭臂路程占总路程的比例。结果表明,运动疲劳可能抑制了小鼠的探索行为并诱导焦虑样表现,而SCP和NMN可能改善运动疲劳的小鼠探索行为下降和焦虑样表现。

由图5(g)可知,与Control组相比,EF组小鼠在旷场实验中主要沿边缘活动、进入中心区域次数减少,在高架十字迷宫中更多停留于闭臂;而SCP和NMN干预后,小鼠中心区域及开放臂探索行为明显增加。

2.2.4 SCP对运动疲劳小鼠肌纤维形态的影响

腓肠肌H&E染色实验结果见图6。由图6(a)和图6(b)可知,Control组腓肠肌纤维排列较为整齐,但可见少量肌束间隙;与Control组相比,EF组肌纤维结构出现紊乱,部分区域肌纤维间隙增大,排列较为疏松,提示运动疲劳可能引起腓肠肌组织损伤。与EF组相比,SCP和NMN组的肌纤维排列更为紧密,横切面中肌纤维边界清晰,纵切面走向规整,间隙减少。本研究结果表明,SCP和NMN可能减轻运动疲劳引起的腓肠肌损伤。

2.2.5 SCP对运动疲劳小鼠血清生化指标及糖原水平的影响

高强度运动会导致肝血流分布失衡并引发肝功能损伤,同时促进蛋白质分解和炎症反应,表现为血清ALT、AST和BUN升高,以及炎症相关指标异常[27-29]。运动疲劳可引发骨骼肌损伤并增加代谢负荷,其典型特征为血清CK持续升高,并伴随CRE水平上升,从而反映肌肉损伤和代谢应激状态[30]。睾酮/皮质醇(testosterone/cortisol)比值被用作合成代谢与分解代谢状态的重要指标,并常用于评估运动诱发的疲劳[31],血清生化指标及糖原含量检测结果见图7。由图7(a)至图7(h)可知,与Control组相比,EF组血清ALT、AST、BUN、CRE、CK、IL-6、IL-1β水平均显著升高,而testosterone/cortisol比值显著下降。与EF组相比,NMN组ALT和AST水平显著降低,SCP和NMN组BUN和CK水平显著降低,SCP组CRE和IL-1β水平显著降低,NMN组的CRE和IL-1β无显著变化,SCP和NMN组testosterone/cortisol比值显著升高。IL-6水平在SCP和NMN干预后未见显著下降。结果表明,SCP和NMN可能对运动疲劳引起的肝损伤和肌肉代谢应激具有一定保护作用。

糖原主要储存在骨骼肌和肝脏等组织中,是运动过程中ATP生成的重要能源。肌糖原和肝糖原储备越充足,越有利于提高运动能力[32-33]。同时,糖原储存水平对于运动疲劳后的肌肉恢复至关重要,运动疲劳可消耗机体糖原,导致能量供应不足,引起运动能力下降并诱发疲劳[34]。由图7(i)和图7(j)可知,与Control组相比,EF组小鼠肌糖原和肝糖原水平均显著下降;与EF组相比,SCP干预显著提高了小鼠肌糖原和肝糖原水平,NMN干预显著提高肝糖原水平,但对肌糖原无显著影响。

2.2.6 SCP对运动疲劳小鼠能量代谢和炎症相关通路基因表达水平的影响

运动疲劳可引起氧化应激、线粒体结构异常及功能障碍。线粒体动力学调节使细胞能够适应运动疲劳所引起的骨骼肌能量需求变化[35]。AMPK/PGC-1α信号通路可在调节线粒体裂变与融合过程中发挥重要作用。AMPK作为运动和肌肉收缩能量传感器,激活后可促进葡萄糖摄取和脂肪酸氧化,从而产生抗疲劳效果[36];PGC-1α通常受AMPK信号激活,可以通过增强线粒体生物合成、促进糖原储存和增强脂肪酸氧化能力发挥抗疲劳效果[36-37]。炎症是导致小鼠运动疲劳的因素之一,升高的促炎细胞因子可激活NF-κB信号,并引发炎症反应和线粒体功能障碍[2]。

RT-qPCR实验结果见图8。由图8(a)至图8(f)可知,与Control组相比,EF组小鼠中AMPKα1、AMPKα2、PGC-1α的mRNA表达水平均显著下调,运动疲劳可能损伤以AMPK/PGC-1α为核心的能量代谢与线粒体生物发生调控通路;与EF组相比,SCP可提高AMPKα1、AMPKα2、PGC-1α的mRNA表达;与Control组相比,EF组小鼠中炎症相关基因TLR4、MyD88、p65的mRNA表达水平均显著增加;与EF组相比,SCP可降低TLR4、MyD88及p65的mRNA表达。本研究表明,SCP可能通过上调能量代谢及线粒体生物合成相关基因的表达水平,并下调TLR4/MyD88/NF-κB炎症信号通路相关基因表达,从而发挥抗疲劳作用。

2.3 SCP对运动疲劳小鼠肠道菌群结构的影响

已有研究表明,运动能力与肠道微生物群稳态存在相互作用。运动疲劳是导致菌群失调的重要因素,而菌群失调可能加剧运动疲劳,导致运动能力下降[38]。研究表明,运动疲劳可降低肠道菌群的多样性和丰富度[39]。为探究SCP对运动疲劳小鼠的肠道菌群影响,本研究通过对小鼠粪便样本进行16S rRNA测序,分析不同处理组的肠道菌群组成,分析结果见图9。图9(a)显示,Control组、EF组和SCP组三者共有516个OTU,此外三组分别特有235、335和283个OTU。由图9(b)和图9(c)可知,主坐标分析(PCoA)和非度量多维尺度(NMDS)均显示EF组与Control组肠道菌群结构分离,而SCP干预8周后小鼠肠道菌群结构发生改变,逐渐向Control组靠近。

由图9(d)可知,在门水平上,与Control组相比,EF组小鼠肠道中Firmicutes/Bacteroidota比值升高,Campylobacterota和Desulfobacterota_I相对丰度增加,Verrucomicrobiota相对丰度降低。SCP能增加Verrucomicrobiota相对丰度,并抑制Campylobacterota和Desulfobacterota_I相对丰度升高。由图9(e)可知,在科水平上,与Control组相比,EF组中Erysi-pelotrichaceae 相对丰度增加,而Muribaculaceae、Lactobacillaceae和Akkermansiaceae相对丰度降低,本研究表明,补充SCP改善了这一失衡。由图9(f)可知,在属水平上,与Control组相比,EF组中有益相关菌群如Ligilactobacillus、Akkermansia和Muribacu-lum 相对丰度降低,而潜在致病或炎症相关菌如Parasutterella和Dubosiella相对丰度升高。SCP干预能够提高Ligilactobacillus、Akkermansia和Muribaculum相对丰度,并降低Parasutterella相对丰度。

由图9(g)的LEfSe分析结果可知,EF组小鼠肠道中Erysipelotrichales、Ruminococcus_E、Clostri-dium 相关分类单元及Mycoplasmoidaceae等菌群显著富集,而SCP干预后,Lactobacillus的丰度增加。

已有研究表明,降低Firmicutes/Bacteroidota比值能够促进短链脂肪酸(SCFAs)生成,并降低感染风险[40]。Campylobacterota的增加与溃疡性结肠炎密切相关[41]。Desulfobacterota的丰度不仅与血清TNF-α水平呈正相关,还与多种神经系统疾病及抑郁样行为相关,其下调可改善抑郁样行为[42-43]。本研究结果显示,SCP可降低Firmicutes/Bacteroidota比值,降低Campylobacterota和Desulfobacterota相对丰度,增加Verrucomicrobiota相对丰度。推测SCP可通过改善肠道炎症从而缓解运动诱导疲劳。Erysipelotrichaceae相对丰度升高与胃肠道炎症性疾病、代谢异常及TNF-α升高相关[44-45],并常在运动疲劳模型中富集[46]。Muribaculaceae能分解黏蛋白和膳食纤维,产生SCFAs以维持能量供给、促进黏液分泌、抵御病原菌并保护肠道屏障;Akkermansiaceae被认为是新一代益生菌,可调节肠道通透性并维持肠道屏障完整性[47];Lactobacillaceae属于乳酸菌相关类群,通常被认为具有益生作用[48]。SCP干预有效恢复了Muribaculaceae、Akkermansiaceae与Lactobacillaceae功能菌的相对丰度,为“SCP可调节运动疲劳小鼠肠道菌群”的观点提供了有力证据。EF组中Parasutterella相对丰度增加,据研究发现,肠易激综合征(IBS)患者肠道中Parasutterella的丰度明显升高,这可能与慢性肠道炎症有关[49]。此外,EF组Dubosiella相对丰度也有所上升,已有研究显示,运动疲劳可导致小鼠体内Dubosiella富集,Dubosiella相对丰度升高与运动表现、糖原、ATP和抗氧化酶活性呈负相关[40]。因此,SCP可能通过调节肠道菌群的组成减轻运动疲劳,后续研究将检测粪便SCFAs水平,以验证SCP缓解运动诱导疲劳与SCFAs代谢的关系。此外,本研究肠道菌群分析样本量较小,后续深入研究需要加大样本量。

图9(d)至(f)为各组小鼠在门、科、属水平前10优势菌群的组成及相对丰度;图9(g)为各组小鼠肠道菌群的LEfSe分析(LDA score>3,属水平及以上的差异菌群)。16S rRNA测序,初始每组采集5份粪便样品,部分样品因测序质控不合格被剔除,最终每组保留4份有效样品用于后续分析。

3 结 论

本研究通过行为学测试、腓肠肌H&E染色、血清生化指标检测、能量代谢和炎症反应相关基因表达分析以及肠道菌群分析,评价了SCP对小鼠运动疲劳的改善作用。结果表明,SCP可延长运动疲劳小鼠负重游泳力竭时间,提高握力和延长转棒停留时间,并改善小鼠焦虑样行为。血清指标及糖原水平分析结果显示,SCP可降低小鼠血清中BUN、CRE和CK水平,提高testosterone/cortisol比值,同时增加肝糖原和肌糖原储备,减轻腓肠肌纤维损伤。RT-qPCR结果显示,SCP可上调AMPKα1、AMPKα2和PGC-1α的mRNA表达水平,下调TLR4、MyD88及p65的mRNA表达水平。肠道菌群分析结果显示,SCP可改善运动疲劳引起的小鼠肠道菌群失衡,表现为Muribaculaceae、Lactobacillaceae和Akkermansiaceae等有益菌相对丰度升高,Parasutterella等潜在有害菌相对丰度降低。SCP可能通过改善能量代谢、减轻炎症反应和调节肠道菌群结构发挥抗疲劳作用。本研究旨在为SCP在抗疲劳功能食品中的应用提供理论参考,但SCP通过调节肠道菌群发挥抗疲劳作用的具体机制仍需进一步研究。

参考文献：

[1] MEEUSEN R, VAN CUTSEM J, ROELANDS B. Endu-rance exercise-induced and mental fatigue and the brain[J]. Experimental Physiology, 2021, 106(12): 2294-2298.

[2] ZHAO R, WU R, JIN J, et al. Signaling pathways regulated by natural active ingredients in the fight against exercise fatigue-a review[J]. Frontiers in Pharmacology, 2023, 14: 1269878.

[3] LIU Y, LI C, SHEN X, et al. The use of traditional Chinese medicines in relieving exercise-induced fatigue[J]. Frontiers in Pharmacology, 2022, 13: 969827.

[4] 任娇艳, 王敏, 侯传丽, 等. 食源性肽的功能特性评价方法、分子构效关系及吸收代谢机制[J]. 食品科学技术学报, 2023, 41(2): 7-22.REN J Y, WANG M, HOU C L, et al. Research progress on evaluation method of functional characteristics of food-derived peptides, molecular structure-activity relationship and absorption and metabolism mechanism[J]. Journal of Food Science and Technology, 2023, 41(2): 7-22.

[5] ZHOU S, HAOXIANG C, CHENSI G, et al. Evaluation of Schisandra chinensis extract on anti-fatigue activity in mice[J]. Food Bioscience, 2023, 56: 103129.

[6] HUANG S, WANG Y, LI M, et al. Identification and anti-fatigue activity of walnut protein hydrolysate[J]. Nutrients, 2025, 17(6): 1002.

[7] ZHOU Y, CHU Z, LUO Y, et al. Dietary polysaccharides exert anti-fatigue functions via the gut-muscle axis: advances and prospectives[J]. Foods, 2023, 12(16): 3083.

[8] 孙丽薇, 耿倩, 郑国华. 肠道菌群-肠-脑-肌轴信号交流的研究进展[J]. 微生物学报, 2024, 64(5): 1364-1377.SUN L W, GENG Q, ZHENG G H. Research progress in signaling of gut microbiota-gut-brain-muscle axis[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2024, 64(5): 1364-1377.

[9] HE Y, HU H, LIANG X, et al. Gut microbes-muscle axis in muscle function and meat quality[J/OL]. Science China Life Sciences, 2025[2025-09-30]. https:∥link.springer.com/article/10.1007/s11427-024-2885-4.

[10] 毛相朝, 董浩. 海洋食品配料研究现状与发展趋势[J]. 食品科学技术学报, 2024, 42(6): 1-14.MAO X C, DONG H. Research status and development trend of marine food ingredients[J]. Journal of Food Science and Technology, 2024, 42(6): 1-14.

[11] FENG J, WANG H, LUO X, et al. Identification and molecular mechanism of the anti-inflammatory effect of sea cucumber peptides: network pharmacology, molecular docking and animal experiments[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2024, 279: 134958.

[12] 孙小飞, 罗国瑞, 刘念, 等. 海参多肽生物活性研究进展[J]. 中国食品学报, 2023, 23(9): 409-419.SUN X F, LUO G R, LIU N, et al. Research progress on bioactivities of sea cucumber polypeptides[J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2023, 23(9): 409-419.

[13] LU Z, SUN N, DONG L, et al. Production of bioactive peptides from sea cucumber and its potential health bene-fits: a comprehensive review[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2022, 70(25): 7607-7625.

[14] 叶迪. 海参多肽对Ⅱ型糖尿病大鼠肝脏糖脂代谢及肠道菌群的调节及相关产品研发[D]. 南昌: 南昌大学, 2021.YE D. Regulation of sea cucumber polypeptide on liver glucose and lipid metabolism and intestinal flora in type II diabetic rats and development of related products[D]. Nanchang: Nanchang University, 2021.

[15] 金丹莉. 橙足海参(Cucumaria frondosa)肽对溃疡性结肠炎小鼠的改善机制研究[D]. 杭州: 浙江工商大学, 2024. JIN D L. Study on the improvement mechanism of sea cucumber (Cucumaria frondosa) peptide on mice with ulcerative colitis[D]. Hangzhou: Zhejiang Gongshang University, 2024.

[16] 伍先伟. 多肽减轻由H2O2诱导C2C12细胞损伤和延缓衰老动物的肌肉减少的研究[D]. 广州: 广东药科大学, 2022. WU X W. Peptides alleviate the damage of C2C12 cells induced by H2O2 and delay the decrease of muscle in aging animals[D]. Guangzhou: Guangdong Pharmaceutical University, 2022.

[17] 史亚萍, 张玉, 张绵松, 等. 海参肽的提取分离及其体外抗氧化活性[J]. 食品工业, 2019, 40(7): 44-48. SHI Y P, ZHANG Y, ZHANG M S, et al. Extraction and separation of sea cucumber polypeptide and its antioxidant activity in vitro[J]. The Food Industry, 2019, 40(7): 44-48.

[18] WAN H, HAN J, TANG S, et al. Comparisons of protective effects between two sea cucumber hydrolysates against diet induced hyperuricemia and renal inflammation in mice[J]. Food &Function, 2020, 11(1): 1074-1086.

[19] SONG Q, ZHOU X, XU K, et al. The safety and antiaging effects of nicotinamide mononucleotide in human clinical trials: an update[J]. Advances in Nutrition, 2023, 14(6): 1416-1435.

[20] IGARASHI M, NAKAGAWA-NAGAHAMA Y, MIURA M, et al. Chronic nicotinamide mononucleotide supplementation elevates blood nicotinamide adenine dinucleo-tide levels and alters muscle function in healthy older men[J]. npj Aging, 2022, 8(1): 5.

[21] YANG Y, ZHAO Y, LEI H. Alleviating effect of Lactobacillus rhamnosus SDSP202418 on exercise-induced fatigue in mice[J]. Frontiers in Microbiology, 2024, 15: 1420872.

[22] SILVA-SANTOS T, GUERRA R S, VALDIVIESSO R, et al. Hand grip force-time curve indicators evaluated by dynamometer: a systematic review[J]. Nutrients, 2024, 16(12): 1951.

[23] HUANG L, XIAO D, SUN H, et al. Behavioral tests for evaluating the characteristics of brain diseases in rodent models: optimal choices for improved outcomes (review)[J]. Molecular Medicine Reports, 2022, 25(5): 183.

[24] 张晓晓, 张博威, 刘敬祺, 等. 运动疲劳对大鼠焦虑情绪及脑内星形胶质细胞的影响[J]. 神经解剖学杂志, 2022, 38(6): 664-670.ZHANG X X, ZHANG B W, LIU J Q, et al. The effects of exercise-induced chronic fatigue on anxiety and brain astrocyte in rats[J]. Chinese Journal of Neuroa-natomy, 2022, 38(6): 664-670.

[25] MEEUSEN R, WATSON P, HASEGAWA H, et al. Central fatigue: the serotonin hypothesis and beyond[J]. Sports Medicine, 2006, 36(10): 881-909.

[26] 李雯晖, 王敏, 李赫, 等. 大豆蛋白和大豆肽对小鼠焦虑样行为的作用研究[J]. 食品科学技术学报, 2024, 42(5): 41-50.LI W H, WANG M, LI H, et al. Study on effects of soybean protein and soybean peptides on anxiety-like behavior in mice[J]. Journal of Food Science and Technology, 2024, 42(5): 41-50.

[27] JUAN S, LEE J H, WON S J, et al. Effect of saengmaeksan on fatigue, liver function, and immunity combined with high-intensity training[J]. Journal of Immunology Research, 2023, 2023(1): 3269293.

[28] CORSETTI R, BARASSI A, PEREGO S, et al. Changes in urinary amino acids excretion in relationship with muscle activity markers over a professional cycling stage race: in search of fatigue markers[J]. Amino Acids, 2016, 48(1): 183-192.

[29] BI Y, LIU X, LIU Y, et al. Molecular and biochemical investigations of the anti-fatigue effects of tea polyphenols and fruit extracts of Lycium ruthenicum Murr. on mice with exercise-induced fatigue[J]. Frontiers in Molecular Biosciences, 2023, 10: 1223411.

[30] LPEZ S A, VILLANUEVA M A, CARMONA G D C, et al. The role of biomarkers in monitoring chronic fatigue among male professional team athletes: a systema-tic review[J]. Sensors, 2024, 24(21): 6862.

[31] ZUREK G, DANEK N, A, et al. Effects of dominance and sprint interval exercise on testosterone and cortisol levels in strength-, endurance-, and non-training men[J]. Biology, 2022, 11(7): 961.

[32] IVY D J L. Muscle glycogen synthesis before and after exercise[J]. Sports Medicine, 1991, 11(1): 6-19.

[33] LPEZ-SOLDADO I, GUINOVART J J, DURAN J. Increased liver glycogen levels enhance exercise capacity in mice[J]. The Journal of Biological Chemistry, 2021, 297(2): 100976.

[34] LI T, XIE C, TIAN Z, et al. A soluble garlic polysaccharide supplement alleviates fatigue in mice[J]. npj Science of Food, 2024, 8(1): 98.

[35] VOOS K M, TZENG J, PATEL P, et al. Ankyrin-B modulates mitochondrial fission in skeletal muscle and is required for optimal endurance exercise capacity[J]. Nature Communications, 2025, 16(1): 7671.

[36] WANG Z, XIA T, JIN S, et al. Chronic restraint stress-induced muscle atrophy leads to fatigue in mice by inhibiting the AMPK signaling pathway[J]. Biomedicines, 2021, 9(10): 1321.

[37] AGUDELO L Z, FERREIRA D M S, DADVAR S, et al. Skeletal muscle PGC-1α1 reroutes kynurenine metabolism to increase energy efficiency and fatigue-resistance[J]. Nature Communications, 2019, 10(1): 2767.

[38] YANG K, ZHANG Y, FANG F, et al. The structural characteristics, beneficial effects and biological mechanisms of food and medicinal plant polysaccharides on exercise-induced fatigue: a review[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2025, 311(P4): 144046.

[39] LI Q, WEN X, WANG G, et al. Gut microbiota and exercise-induced fatigue: unraveling the connections[J]. Food Science of Animal Products, 2024, 2(2): 9240061.

[40] HUANG S, SUN H, LIN D, et al. Camellia oil exhibits anti-fatigue property by modulating antioxidant capacity, muscle fiber, and gut microbial composition in mice[J]. Journal of Food Science, 2024, 89(4): 2465-2481.

[41] NACHAMKIN I, ALLOS B, HO T. Campylobacter species and Guillain-Barre syndrome[J]. Clinical Microbio-logy Reviews, 1998, 11(3): 555-567.

[42] WEI X, XING F, XU Y, et al. Preoperative gut microbiota of POCD patients induces pre- and postoperative cognitive impairment and systemic inflammation in rats[J]. Journal of Neuroinflammation, 2024, 21(1): 221.

[43] RAO J, XIE R, LIN L, et al. Fecal microbiota transplantation ameliorates gut microbiota imbalance and intestinal barrier damage in rats with stress-induced depressive-like behavior[J]. European Journal of Neuroscience, 2021, 53(11): 3598-3611.

[44] KAAKOUSH N O. Insights into the role of Erysipelotrichaceae in the human host[J]. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 2015, 5: 84.

[45] DINH D M, VOLPE G E, CHAD D, et al. Intestinal microbiota, microbial translocation, and systemic inflammation in chronic HIV infection[J]. Journal of Infectious Diseases, 2015, 211(1): 19-27.

[46] LI Y, LI Q, XU W, et al. Resveratrol alleviated intensive exercise-induced fatigue involving in inhibiting gut inflammation and regulating gut microbiota[J]. Food Science &Nutrition, 2025, 13(6): e70304.

[47] ZHU Y, CHEN B, ZHANG X, et al. Exploration of the Muribaculaceae family in the gut microbiota: diversity, metabolism, and function[J]. Nutrients, 2024, 16(16): 2660.

[48] KOLTAI E, MOZAFFARITABAR S, ZHOU L, et al. PGC-1 alpha overexpression in the skeletal muscle results in a metabolically active microbiome which is independent of redox signaling[J]. Scientific Reports, 2025, 15(1): 20527.

[49] CHEN Y J, WU H, WU S D, et al. Parasutterella, in association with irritable bowel syndrome and intestinal chronic inflammation[J]. Journal of Gastroenterology and Hepatology, 2018, 33(11): 1844-1852.

Effects of Sea Cucumber Crude Peptides on Exercise Fatigue and Gut Microbiota in Mice

SU Jiawen1, LI Xiaolong1, HU Yanyun1, HUANG Kailei1, CHEN Jun1,XIE Zhihui2, HUANG Hongliang1,*

(1. School of Life Sciences and Biopharmaceuticals, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China;2. Xie Zhihui Biomedical Research Institute Guangzhou Co., Ltd., Guangzhou 510006, China)

Abstract： To evaluate the regulatory effects of sea cucumber crude peptides (SCP) on exercise fatigue and gut microbiota dysbiosis in mice, SCP was prepared from sea cucumber (Apostichopus japonicus). Six-week-old male C57BL/6J mice were divided into four groups: Control group, exercise fatigue (EF) group, SCP group, and β-nicotinamide mononucleotide (NMN) group. Exercise endurance was assessed by weighted swimming, grip strength, and rotarod tests. Anxiety-like behaviors induced by exercise fatigue were evaluated using the open-field test and elevated plus maze tests. Muscle, serum, and fecal samples were collected for H&E staining, biochemical analysis, RT-qPCR, and 16S rRNA sequencing. The results showed that, compared with the Control group, mice in the EF group exhibited significantly decreased exercise endurance and markedly increased anxiety-like behaviors. Serum levels of alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase, urea nitrogen, creatinine, creatine kinase, interleukin-6, and interleukin-1β were significantly elevated, while the serum testosterone/cortisol ratio in EF mice was significantly decreased. Compared with the EF group, supplementation with SCP and NMN significantly prolonged the weighted swimming exhaustion time and increased grip strength and rotarod retention time in mice. The open-field and elevated plus maze tests showed that SCP and NMN supplementation improved anxiety-like behaviors in mice with exercise fatigue. Meanwhile, SCP reduced serum urea nitrogen and creatine kinase levels in mice. RT-qPCR results showed that SCP upregulated the mRNA expression levels of AMPKα1, AMPKα2 and PGC-1α and downregulated the mRNA expression levels of TLR4, MyD88, and p65. The 16S rRNA sequencing results showed that, compared with the Control group, the relative abundance of potentially harmful bacteria, such as Parasutterella and Erysipelotrichaceae, was increased in the gut of EF mice, whereas the relative abundance of beneficial bacteria, including Muribaculaceae, Lactobacillaceae, and Akkermansiaceae, was decreased. Compared with the EF group, SCP intervention increased the relative abundance of Muribaculaceae and Akkermansiaceae. SCP enhanced exercise endurance, alleviated muscle injury, and improved anxiety-like behaviors induced by exercise fatigue in mice. In addition, SCP may exert anti-fatigue effects by regulating the gut microbiota structure. This study may provide new insights into the development and application of SCP in anti-fatigue functional foods.

Keywords： sea cucumber crude peptides; exercise fatigue; gut microbiota; AMPK/PGC-1α related genes; TLR4/p65 related genes

doi：10.12301/spxb202500500

文章编号：2095-6002(2026)03-0122-16

引用格式：苏嘉文, 李晓龙, 胡燕芸, 等. 海参粗多肽对小鼠运动疲劳及肠道菌群的影响[J]. 食品科学技术学报,2026,44(3):122-137.

SU Jiawen, LI Xiaolong,HU Yanyun, et al. Effects of sea cucumber crude peptides on exercise fatigue and gut microbiota in mice[J]. Journal of Food Science and Technology, 2026,44(3):122-137.

中图分类号： TS201.4

文献标志码： A

收稿日期： 2025-10-13

基金项目： 广州新药筛选模型体系构建与应用重点实验室开放课题资助项目(201805010006); 中国本科生创新创业项目(S202210573038)。

Foundation: Open Fund Project of Guangzhou Key Laboratory for Construction and Application of New Drug Screening Model Systems (201805010006); Innovation and Entrepreneurship Projects for Chinese Undergraduate (S202210573038).

第一作者： 苏嘉文,女,硕士研究生,研究方向为海参肽的生物活性。

*通信作者： 黄宏靓,男,教授,博士,主要从事生物医药方面的研究。

(责任编辑：叶红波)