蓝莓(Vaccinium spp.)富含多酚类化合物,因其卓越的抗氧化活性而备受关注。蓝莓中的酚酸类化合物具有显著的自由基清除力、抗炎和抗衰老等生物活性[1-2],同时对预防心血管疾病、糖尿病和癌症等慢性疾病具有潜在的保护作用[3-5]。但由于蓝莓果实在采摘后极易腐烂,难以保存,因此常用于制备果汁、果酒等饮品[6]。但目前对在蓝莓果汁加工过程中产生的果渣(占鲜果质量的20%～30%)关注度较少,常被作为土地堆肥或直接丢弃,造成资源浪费与环境污染[7]。蓝莓副产物是多酚类活性物质的主要来源,如何通过生物转化提升蓝莓全果的利用率并增强其功能活性,已成为食品科学领域的热点问题。

食用植物酵素(edible plant Jiaosu)是以可用于食品加工的植物为主要原料,添加或不添加辅料,经微生物发酵制得的含有特定生物活性成分可供人类食用的酵素产品[8]。在发酵过程中不仅保留了原料中丰富的维生素、矿物质和植物活性成分,还生成大量酶类、有机酸及抗氧化物质[9],具有促进消化[10]、调节肠道菌群[11]、增强免疫力[12]等健康功效。作为一种天然发酵产品,食用植物酵素在现代健康饮食中备受关注,逐渐成为日常营养补充和身体调理的理想选择之一。乳酸菌属细菌是发酵食品中最重要的一类发酵剂[13],它们能够与其他微生物进行联合发酵从而大大提高产品的风味及其品质[14]。Tang等[15]采用干酪乳杆菌和植物乳植杆菌发酵红树莓汁,显著改变了发酵液中的次生代谢物谱,尤其是酚酸、黄酮类和生物碱物质的组成。由于蓝莓中的多酚类化合物通常以结合态存在,其在人体内的功能发挥受到限制[16]。通过微生物发酵,不仅可以提高蓝莓中活性成分的释放和生物利用度,还能产生新的代谢产物,进一步增强其生物活性。有研究表明,发酵过程中产生的某些代谢产物(如短链脂肪酸、酚类衍生物等)与抗氧化活性密切相关。例如,乳酸菌发酵过程中产生的乳酸和乙酸能够增强植物基食品的抗氧化能力[17]。

麻江蓝莓产于贵州省黔东南苗族侗族自治州麻江县,具有个头小,但营养价值高、原生态性强的特点,但开发不足。笔者团队通过前期的工艺研究发现,采用酵母菌和植物乳杆菌协同发酵制备蓝莓酵素能够更好地保留蓝莓果实中的活性成分,尤其是花青素和黄酮。同时,还能够避免单一菌群长期占据发酵主导地位,形成单一的代谢产物堆积。本研究结合代谢组学技术,分析双菌连续接种发酵对蓝莓果汁和果渣中生物活性物质释放的促进作用,并揭示微生物在不同蓝莓基质发酵过程中代谢途径的差异性选择。希望研究可为麻江蓝莓酵素产品的功能性开发提供理论参考,促进麻江蓝莓的综合利用和精深加工。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜蓝莓来自贵州省黔东南苗族侗族自治州麻江县蓝莓种植示范基地。

BV818酵母、RW酵母,宜昌安琪酵母股份有限公司;植物乳杆菌GDM1.191(菌种保藏编号GDMCC1.191),广东省微生物菌种保藏中心;果葡糖浆,湖北中超食品科技有限公司;果浆酶(酶活力1×105 U/g),诺维信生物技术有限公司;抗坏血酸,上海试四赫维化工有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)测试盒,南京建成生物科技有限公司;实验所用其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

8890B-5977B型液相色谱-质谱联用仪[配置DB-5MS毛细管柱(40 m×0.25 mm×0.25 μm)],美国Agilent公司;ACQUITY型液相色谱-AB5000质谱联用仪[配置ACQUITY UPLC®BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm),美国Waters公司],美国AB SCIEX公司;SuPerMax3100型多功能酶标仪,上海闪谱公司;ATC型手持糖度计,杭州陆恒生物科技有限公司;ZD-85A型气浴恒温振荡器,常州朗越仪器制造公司;TG16-WS型台式高速离心机,湖南湘仪试验室仪器有限公司;SN-CJ-IF型超净工作台,上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.3 实验方法

1.3.1 菌种活化

BV818酵母、RW酵母活化:分别取0.03 g菌粉于2个无菌烧杯中,加入10 mL无菌水,于37 ℃恒温水浴锅中活化30 min后待用。

植物乳杆菌GDM1.191活化:将甘油保藏管中的菌株接种在MRS液体培养基中于37 ℃恒温培养箱中活化48 h。然后将菌液离心(4 ℃,10 000 r/mim,10 min)后收集,用无菌水洗涤2次,取适当稀释梯度的菌液,采用倾注平板法进行微生物数量的测定。最终接种菌液浓度约为8 lg CFU/mL。

1.3.2 蓝莓果汁酵素和蓝莓果渣酵素的制备

将新鲜蓝莓洗净后用紫外线进行外部杀菌,在超净工作台内进行压榨、过滤得到蓝莓果汁和果渣。

蓝莓果汁酵素的制备:取200 mL蓝莓果汁加入体积分数5%的果葡糖浆,巴氏灭菌30 min。倒入无菌发酵罐,接种 BV818酵母菌液,于微氧条件下(由通气阀控制),28 ℃发酵16 h。酵母菌发酵结束后接种体积分数为1%植物乳杆菌GDM1.191菌液,然后立即关闭所有通气阀,于35 ℃无氧环境中继续发酵24 h得到蓝莓果汁酵素。

蓝莓果渣酵素的制备:取80 g蓝莓果渣与无菌水混匀[m(蓝莓果渣)∶V(水)=1 g∶2.5 mL,该比例是在参考文献[18]的基础上进行条件优化后得到],加入0.8 g果浆酶,49 ℃条件下密封酶解2.6 h。然后加入体积分数为7.5%的果葡糖浆,巴氏灭菌 30 min 后倒入500 mL无菌发酵罐。然后接种 RW酵母菌液,于微氧条件下(由通气阀维持),30 ℃条件下发酵16 h。酵母菌发酵结束后接种体积分数为2%植物乳杆菌GDM1.191菌液,然后立即关闭所有通气阀,于35 ℃无氧环境中继续发酵24 h得到发酵蓝莓果渣酵素。所有样品均以10 000 r/min 速度离心15 min,过滤,收集上清液用于进一步分析。

1.3.3 基本理化指标的测定

总糖含量测定参考文献[19]的方法,采用苯酚-硫酸法测定。取1 mL样品加入1 mL 50 mg/mL苯酚溶液,混匀。然后迅速加入5 mL浓硫酸,混匀反应10 min。于30 ℃水浴20 min,冷却至室温。在490 nm处测定其吸光度。以葡萄糖作为标准溶液(y=10.061x-0.008 2,R2=0.999 2,线性浓度范围为0～0.1 mg/mL),结果以每毫升样品中葡萄糖当量表示。

总酸、γ-氨基丁酸含量和乳酸菌活菌数参照QB/T 5323—2018《植物酵素》进行测定。

1.3.4 花青素、黄酮和总酚含量的测定

花青素含量(total anthocyanin content,TAC)采用pH示差法进行测定,参考文献[20]的方法,稍作修改。取4 mL样品,在40 ℃水浴条件下分别加入4 mL pH=1.0的磷酸盐缓冲液和4 mL pH=4.5的磷酸盐缓冲液反应。在510 nm和700 nm处测定样品吸光度,以蒸馏水作为空白对照。结果以每毫升样品中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷当量表示。TAC的计算方法见式(1)和式(2)。

A=(A510 nm,pH1.0-A700 nm,pH1.0)-

(A510 nm,pH4.5-A700 nm,pH4.5) ;

(1)

(2)

式(2)中,Mw为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷分子质量,449.2 g/mol;D为稀释倍数;V为液体体积,mL;ε为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的消光系数,29 600 L/(mol·cm);L为光程,cm;m为样品质量,g。

黄酮含量参考文献[20]方法进行测定,稍加修改。取1 mL样品稀释5倍后加入1 mL 50 mg/mL的NaNO2溶液,混合反应6 min。然后加入1 mL 100 mg/mL硝酸铝和4 mL 100 mg/mL氢氧化钠,混合反应15 min。在510 nm处测定吸光度,以芦丁作为标准溶液(y=0.471x+0.002,R2=0.999 2,线性浓度为0～0.4 mg/mL),结果以1 mL样品中芦丁当量表示。

总酚含量参考文献[21]的方法,稍加修改。取1 mL样品加入1 mL福林酚试剂混匀反应3 min。然后加入3 mL 75 mg/mL碳酸钠,于75 ℃水浴避光反应30 min。在765 nm波长处测定吸光度。以没食子酸作为标准溶液(y=0.012 2x+0.000 6,R2=0.999 1,线性浓度为0～50 mg/L),结果以1 mL样品中没食子酸当量表示。

1.3.5 SOD活性的测定

参考试剂盒中的概述指南(WST-1方法)进行测定,结果以U/100 g表示。

1.3.6 感官评价方法

随机挑选食品科学专业学生10名,进行相关培训后对蓝莓酵素的色泽(20分)、香气(20分)、口感(20分)、形态(20分)、滋味(20分)进行感官评价。

1.3.7 有机酸含量的测定

采用LC-MS测定发酵前后蓝莓果汁酵素和蓝莓果渣酵素中的有机酸含量。

色谱条件:使用ACQUITY UPLC® BEH C18色谱柱,样品进样量5 μL,柱温40 ℃,流动相A为含体积分数0.1%甲酸的水溶液,流动相B为含体积分数0.1%甲酸的甲醇溶液。梯度洗脱条件为0～3 min,20%～50% B;3～5 min,50%～90% B;5～8 min,90% B;8～9 min,90%～20%B;9～10 min, 20% B;流速 0.4 mL/min。

质谱条件:电喷雾(ESI)电离源,负离子模式。离子源温度500 ℃,离子源电压-4 500 V,碰撞气6 PSI(4.14×104 Pa),气帘气30 PSI(2.07×105 Pa),雾化气和辅助气均为50 PSI(3.45×105 Pa)。采用多重反应监测(MRM)进行扫描。

1.3.8 代谢物组成的测定

采用GC-MS测定发酵前后蓝莓果汁酵素和蓝莓果渣酵素中代谢物的组成。

样品前处理:取100 μL样品加入300 μL提取液[V(甲醇)∶V(乙腈)=2∶1,含0.2 mg/mL内标核糖醇],混匀后冰水浴超声萃取30 min。将样品于-20 ℃静置30 min,然后高速离心15 min (4 ℃,10 000 r/min),取上清装入玻璃衍生小瓶中,氮气吹干。于玻璃衍生小瓶中加入80 μL 15 mg/mL的甲氧胺盐酸盐吡啶溶液,涡旋2 min后于37 ℃振荡培养箱中进行90 min肟化反应。再加入80 μL的BSTFA衍生试剂,于70 ℃反应60 min,取出样本室温放置30 min。

色谱条件:使用DB-5MS毛细管柱,进样量1 μL,分流比10∶1。进样口温度300 ℃,高纯氦气载气流速1 mL/min,隔垫吹扫流速3 mL/min,溶剂延迟5.5 min,初始温度60 ℃,平衡0.5 min。然后以8 ℃/min 的速度升至310 ℃并维持6 min。

质谱条件:电子轰击离子源(EI)传输线温度为310 ℃,离子源温度为280 ℃,四极杆温度为150 ℃,电子能量70 eV。扫描方式为全扫描模式,质量扫描范围m/z为35～550,扫描频率为3.2 次/s。

1.3.9 抗氧化活性的测定

DPPH自由基清除率的测定参照文献[22]的方法。取1 mL样品加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液(溶于体积分数75%的乙醇),避光反应0.5 h。以抗坏血酸为对照,在517 nm处测定吸光值。

ABTS+自由基清除率的测定参照文献[22]的方法,稍作修改。取0.5 mL样品加入4 mL 7 mmol/L ABTS溶液(溶于无水乙醇),避光反应10 min。以抗坏血酸为对照,在734 nm处测其吸光值。

羟基自由基清除率的测定参照文献[23]的方法,稍作修改。取1 mL样品加入1 mL 9 mmol/L硫酸亚铁、1 mL 9 mmol/L水杨酸溶液(溶于无水乙醇)和1 mL 8.8 mmol/L过氧化氢溶液,在37 ℃水浴中反应30 min。以水杨酸溶液为对照,在510 nm处测其吸光值。

铁离子还原能力的测定参照文献[23]的方法,稍作修改。取1 mL样品与2.5 mL 0.2 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH=6.6)和2.5 mL 1 mg/mL亚铁氰化钾混合。在50 ℃条件下水浴20 min,加入等体积的蒸馏水和1/5体积的1 mg/mL氯化铁。以抗坏血酸为对照,在700 nm处测定吸光值。所有结果均以降低百分比表示。

1.4 数据处理

实验结果以平均值±标准差表示,所有实验均为3个平行组。使用 SPSS 26软件对数据进行统计分析,P<0.05为差异显著具有统计学意义。使用Origin 2021进行图标绘制。将非靶向代谢物数据进行均值填充和归一化处理后导入SIMCA 14.0软件进行分析,并采用KEGG数据库鉴定差异代谢物的KEGG ID。

2 结果与分析

2.1 蓝莓酵素发酵前后基本理化指标和活性成分的变化

总糖和总酸的变化是衡量发酵程度的重要指标。在不同蓝莓原料中这些物质含量也有显著差异,果汁中总糖含量较高,而蓝莓果皮中含有大量花青素和鞣酸等物质,从而导致果渣中的总酸含量较高。对发酵前后蓝莓果汁酵素和蓝莓果渣酵素基本理化指标及活性成分进行测定,结果见表1。在发酵后这些指标在不同蓝莓酵素中的变化趋势相一致,总糖含量均有显著下降,而总酸含量有所上升。总糖的减少表明微生物生长旺盛,糖类作为主要的碳源用于自身生长、繁殖以及代谢产物的合成。总酸可以评估发酵后发酵液中酸的积累量,同时也反映了植物乳杆菌在发酵过程中的代谢性能。在发酵结束后蓝莓酵素中的γ-氨基丁酸和总酚含量均有显著提升,这种现象可能归因于微生物产生的一些酶,这些酶可以将果渣中的木质素和纤维素分解成酚类化合物[24]。两种酵素中的SOD活性也有显著上升,这与Espirito-Santo等[25]研究结论相同。他们发现发酵苹果汁中的SOD活性与乳酸杆菌数量密切相关,是影响细胞活性最重要的因素之一。SOD活性的提高表明,在发酵过程中植物乳杆菌的生长状态良好,因为其极大限度地减少了有氧发酵过程中积累ROS的有害影响。对蓝莓果汁和果渣发酵过程中活性物质的含量变化进行分析,结果见图1。发酵过程中两种原料的花青素含量均有所下降,但蓝莓果渣的下降幅度更大[图1(a)]。花青素含量的下降主要与样品前处理及发酵条件密切相关。蓝莓果渣在前处理阶段经过长时间酶解,导致花青素结构发生部分分解。同时,在发酵过程中两组样品的总酸含量均显著上升,且发酵温度始终控制在28 ℃以上。研究表明,花青素在低pH值和长时间温和条件下结构稳定性下降,降解速率显著加快[26]。这与Qin等[27]的结果一致,他们采用W.anomalus FBKL2.00K8菌株发酵覆盆子汁后,花青素含量逐渐下降约99%。黄酮含量在果渣发酵过程中的变化不显著,但在果汁发酵后期出现了下降趋势[见图1(b)]。由于长时间发酵,微生物产生的一系列次级代谢物(丙酮酸和乙醛等)与黄酮反应并改变其结构,致使其难以被检出,最终导致黄酮含量降低[28]。

图1 发酵过程中蓝莓果汁酵素和蓝莓果渣酵素活性物质含量的变化

Fig.1 Changes in bioactive compound content of blueberry juice Jiaosu and blueberry pomace Jiaosu during fermentation

表1 发酵前后蓝莓果汁酵素和蓝莓果渣酵素基本理化指标及活性成分

Tab.1 Physicochemical indices and bioactive components of blueberry juice Jiaosu and blueberry pomace Jiaosu before and after fermentation

样品ρ(总糖)/(mg/mL)ρ(总酸)/(mg/mL)ρ(γ-氨基丁酸)/(mg/mL)ρ(总酚)/(mg/mL)SOD活性/(U/100mL)乳酸菌活菌数/(107 CFU/mL)蓝莓果渣12.13±1.066.73±0.431.48±0.071.38±0.31674.90±27.68ND蓝莓果渣酵素8.28±0.6510.23±0.432.82±0.112.34±0.241622.87±45.321.17±0.04蓝莓果汁23.41±1.520.68±0.030.33±0.044.35±0.082370.77+56.11ND蓝莓果汁酵素14.43±1.251.38±0.011.11±0.075.86±0.113401.54±56.110.76±0.13

ND表示未检出。

2.2 蓝莓酵素感官评价结果

分别对蓝莓果汁酵素和蓝莓果渣酵素进行感官评价,结果见表2。由表2可知,蓝莓果汁酵素和蓝莓果渣酵素综合得分分别为83.70分和72.20分,综合来看蓝莓果汁酵素得分更高。

表2 蓝莓果汁酵素和蓝莓果渣酵素的感官评价结果

Tab.2 Sensory evaluation results of blueberry juice Jiaosu and blueberry pomace Jiaosu

样品评语色泽香气口感形态滋味得分/分蓝莓果汁酵素紫红色,质地均匀,有光泽具有蓝莓果香和发酵清香酸甜爽口、丰满柔和且有回味均匀细腻,无可见外来杂质带有清甜果香,口感顺滑、细胞83.70±6.77蓝莓果渣酵素紫红色,质地均匀,有光泽具有蓝莓果香和发酵清香酸甜适口,入口细腻,口感饱满无杂质,颗粒分散均匀醇厚浓郁,带有些许酸涩感72.20±7.39

2.3 蓝莓酵素发酵前后有机酸组成分析

有机酸是乳酸菌发酵产品的重要评价指标之一,对于产品的感官特征有着显著的影响。有机酸类物质不仅参与了酯类、氨基酸、酚类以及芳香类物质的代谢过程,并且还有助于抑制外来细菌的增长。对样品中有机酸的种类及含量进行分析,结果见表3。 蓝莓果汁和蓝莓果渣在发酵前后共检出18种有机酸,含量较高的前5种有机酸分别为柠檬酸、苹果酸、乳酸、延胡索酸和D-葡萄糖酸。在果汁、果汁酵素和果渣中柠檬酸含量占比最高,分别为48.43%、36.44%和54.37%,但在果渣酵素中乳酸含量占比最高,为53.30%。植物乳杆菌生长主要将糖转化为乳酸,乳酸是植物乳杆菌分解代谢的最终主要产物[29],因此在发酵后总酸含量有所上升。乳酸的生成不仅提高乳酸菌发酵产品的稳定性和营养价值,同时也增加了乳香气味。在发酵结束后,果汁酵素和果渣酵素中的琥珀酸含量也均有显著增加,但柠檬酸含量显著下降。有研究表明,琥珀酸也是乳酸菌在代谢过程中能够产生的较丰富的有机酸种类[30]。柠檬酸是乳酸菌生长的碳源,其含量的降低也是发酵的标志之一[31]。同时,酵母菌也可以通过TCA途径将柠檬酸进一步转化为琥珀酸,从而使柠檬酸含量下降。由于蓝莓果汁和果渣原料中的成分差异,果汁酵素中的苹果酸、D-葡萄糖醛酸、泛酸和焦谷氨酸含量有所下降。但在果渣酵素中这些物质含量有所上升,可能是由于果渣中含有较多的苹果酸,在发酵过程中首先使用苹果酸作为碳源进行代谢[32]。其他有机酸含量较低,但被认为是整体风味特征的次要贡献者,这些有机酸种类的组成,也赋予了产品不同的风味特征。

表3 发酵前后蓝莓果汁酵素和蓝莓果渣酵素中有机酸种类及含量

Tab.3 Types and content of organic acids of bluebemy jvice Jiaosu and blueberry pomace Jiaosu before and after fermentation

有机酸种类t(保留)/min线性方程R2ρ(有机酸)/(μg/mL)蓝莓果渣果渣酵素蓝莓果汁果汁酵素乳酸4.29y=8.67×104x+5.42×1050.9927ND450.23±19.77ND196.89±7.49琥珀酸4.55y=1.29×104x+1.92×1030.99348.66±1.19188.62±7.246.67±0.25175.48±1.52 延胡索酸4.79y=6.6×103x-5110.99120.59±0.030.65±0.072.32±0.020.99±0.12苹果酸3.82y=1.44×104x+1.35×1040.998854.56±2.2872.39±0.07385.18±5.98353.66±2.58柠檬酸4.07y=1.25×104x+2.26×1050.9976134.31±2.2851.97±6.36494.72±9.30471.35±2.02丙二酸3.96y=9.63×103x-2.01×1040.99681.71±0.122.05±0.219.00±0.0611.80±2.02戊二酸5.15y=1.78×104x+6.43×1030.99220.30±0.030.29±0.030.04±0.010.40±0.02香草酸6.79y=1.63×103x+5.74×1030.99145.69±1.190.58±0.083.48±0.283.85±0.02D-葡萄糖醛酸3.37y=3.27×103x+2.6×1030.992935.24±0.9659.42±2.2355.39±1.0443.29±1.42泛酸5.38y=1.07×103x+2.7×1030.99470.20±0.087.89±1.0252.19±1.8729.20±0.47烟酸6.00y=1.78×104x+1.88×1040.99680.05±0.010.04±0.000.30±0.010.24±0.00己二酸3.58y=6.66×103x-1.21×1030.99562.13±0.170.90±0.07NDND酒石酸4.15y=377x+1.23×1030.99100.04±0.004.85± 0.392.16±0.181.89±0.16焦谷氨酸5.34y=7.67×103x+9.5×1030.99190.29±0.010.39± 0.038.50±0.41ND5-羟甲基-2-糠酸7.66y=1.29×104x+1.92×1030.99641.66±0.112.62±0.140.08±0.010.34±0.01苯乳酸4.67y=1.58×103x+8×1030.99521.36±0.211.25±0.110.03±0.002.24±0.043-羟基-3-甲基戊二酸7.35y=1.38×103x-1.83×1030.99640.26±0.03ND1.55±0.081.95±0.03苯丙酮酸7.35y=1.38×103x-1.83×1030.9964ND0.50±0.010.26±0.03ND

ND表示未检出。

2.4 蓝莓酵素中代谢物组成分析及差异代谢物的筛选

发酵是在微生物代谢活动的帮助下进行的生化反应,主要包括糖的分解和转化。通过GC-MS非靶向代谢组学分析,蓝莓果汁酵素和果渣酵素在发酵前后共鉴定出152种代谢物,检出的有机酸类代谢物相对含量最高。有机酸是植物乳杆菌GDM1.191在发酵过程中产生的主要代谢产物,能够赋予食品清新的果香或奶香[33]。醇类是酵母菌在发酵过程中的主要代谢产物,但在不同蓝莓酵素中醇类代谢物检出含量较低。Wang等[34]研究发现,多菌种连续发酵可能会改变酵母菌的代谢特性。他们采用德氏葡萄球菌和酿酒酵母分别以24 h和48 h的间隔连续接种发酵后,与纯酿酒酵母发酵相比,蓝莓发酵饮料中的乙醇含量降低了1.1%。

通过主成分分析(PCA)比较了发酵前后蓝莓果汁酵素和蓝莓果渣酵素中代谢物的差异,结果见图2。由图2(a)可知,PCA分析中前2个主成分(PC1和PC2)占总方差的74.63%。2种蓝莓样品在发酵前后能够进行显著区分,说明发酵后代谢物组成发生了一定程度的变化。对2组样品进行OPLS-DA分析,蓝莓果汁酵素和果渣酵素模型的置换检验结果如图2(b)、图2(c)所示。从中共筛选出了49种差异代谢物(VIP≥1,P<0.05),包括19种糖类、11种有机酸、3种醇、3种酯和9种其他物质。蓝莓果汁发酵前后差异代谢物相对含量如图2(d)所示。在果汁酵素中果糖、β-D-吡喃果糖、D-葡萄糖和山梨糖的相对含量下降,而海藻糖、甘露糖、阿洛酮糖、蜜二糖、纤维二糖和D-吡喃葡萄糖等糖类相对含量有所提高。果糖和葡萄糖在果汁中含量较高,在发酵过程中作为碳源被消耗,导致两者含量下降。山梨糖被认为是维生素C产生过程的中间体,其含量的降低可能与维生素C生成过程有关。海藻糖是一种可用于治疗心脏代谢疾病的二糖[35]。酵母菌可通过磷酸戊糖途径合成海藻糖,海藻糖的积累对酵母细胞维持细胞膜稳定性和提高关键酶的活性具有重要作用,因此在双菌发酵结束后海藻糖相对含量有所上升。甘露糖和阿洛酮糖都是功能性单糖,酵母菌可通过果糖和甘露糖代谢途径将6-磷酸果糖转化为甘露糖。这类单糖含量上升,既可为果汁酵素提高了甜味,还具备调控免疫、调节血糖等有益于人体健康的功能[36]。在发酵后果汁酵素中肌醇含量也有所增加,酵母菌可以通过肌醇-1-磷酸合成途径将6-磷酸葡萄糖转化生成肌醇,这也是果糖和D-葡萄糖含量降低的原因之一。蓝莓果渣发酵前后差异代谢物相对含量如图2(e)所示。蓝莓果渣中有机酸类物质含量占比较高,尤其是葡萄糖酸和奎宁酸。葡萄糖酸含量在发酵前后变化不显著,而奎宁酸有小幅度下降。奎宁酸广泛存在于多种兼具生物和药理活性的植物中,该物质易受温度、pH值、光线等影响发生降解或异构化[37],进而造成含量降低。乳酸含量在发酵结束后有显著的提升,表明植物乳杆菌在发酵过程中代谢性能良好。葡萄糖、海藻糖、阿洛酮糖、蜜二糖和木糖相对含量上升显著,果糖有所下降。发酵初期果糖含量较高,在发酵过程中微生物以果糖为生长碳源,并且可通过自身代谢将其合成海藻糖和阿洛酮糖等功能性糖类,因此在发酵结束后两者含量显著上升。亚油酸的含量在发酵结束后显著降低,Liu等[38]研究发现植物乳杆菌能够将亚油酸转化为共轭亚油酸,并且不同的菌株对亚油酸的生物转化能力存在显著差异。这可能是导致亚油酸含量降低的原因之一。此外,2-O,3-O,5-O-三(三甲基硅基)-D-核糖酸- γ-内酯作为D-核糖酸的修饰结构,具有较好的稳定性,因此其相对含量在发酵前后都较稳定。

图2 发酵前后蓝莓果汁酵素和蓝莓果渣酵素的差异代谢物

Fig.2 Differential metabolites of blueberry juice Jiaosu and blueberry pomace Jiaosu before and after fermentation

2.5 蓝莓酵素差异代谢物的代谢途径分析

为了进一步了解差异代谢物在发酵过程中的关联转化关系 ,采用KEGG通路富集分析,对蓝莓果汁酵素和蓝莓果渣酵素发酵过程中的差异代谢物代谢途径进行分析,结果见图3。在蓝莓果汁酵素中共筛选出7条代谢途径[见图3(a)],蓝莓果渣酵素中共筛选出13条代谢途径[见图3(b)]。分别选择前5条差异最显著的代谢途径进行分析,包括半乳糖代谢、果糖和甘露糖代谢、淀粉和蔗糖代谢、戊糖和葡萄糖醛酸互相转化、抗坏血酸和醛酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、磷酸戊糖途径、乙醛酸盐和二羧酸盐代谢。

图3 蓝莓果汁酵素和蓝莓果渣酵素差异代谢物代谢通路分析

Fig.3 Metabolic pathway analysis of differential metabolites in blueberry juice Jiaosu and blueberry pomace Jiaosu

代谢物具体转化途径如图3(c)所示。半乳糖代谢过程主要涉及蔗糖、D-半乳糖、肌醇、果糖和D-葡萄糖之间的转化。乳糖分解产生的α-D-葡萄糖还可进入果糖和甘露糖代谢过程,参与并转化生成果糖、甘露糖和D-山梨醇。其中,果糖和甘露糖存在互相转化关系,因此在发酵后果渣酵素中两者的相对含量都较高。淀粉和蔗糖代谢途径涉及蔗糖、果糖、D-葡萄糖、纤维二糖、麦芽糖、海藻糖和棉子糖的互相转化。在蓝莓果渣酵素中未富集出果糖和甘露糖代谢途径,表明在发酵过程中果糖的变化主要通过淀粉和蔗糖代谢途径进行。这与关键酶如α-葡萄糖苷酶和蔗糖合酶的活性变化有关,其能够促进淀粉和蔗糖向D-果糖、D-葡萄糖等单糖转化,解释了在发酵后棉子糖等寡糖积累的现象[39]。磷酸戊糖途径主要涉及D-葡萄糖、D-葡萄糖酸盐和D-核糖的互相转化。乙醛酸盐和二羧酸盐代谢主要涉及柠檬酸盐的转化,由于异柠檬酸裂解酶活性的变化,促进了柠檬酸和苹果酸等有机酸的生成,这与发酵液酸度变化及风味形成密切相关[40]。不饱和脂肪酸代谢途径涉及油酸、棕榈酸、硬脂酸和亚油酸。在蓝莓果渣发酵后不饱和脂肪酸含量有所下降,可能是在发酵后期乳酸菌生长繁殖受限,pH值回升,脂肪氧化速度加快导致其含量降低。半乳糖是连接半乳糖代谢、淀粉和蔗糖代谢、果糖和甘露糖代谢、乙醛酸和二羧酸代谢以及甘油酯代谢的关键差异代谢物,可以与其他差异代谢物进行相互转化,显著影响了发酵液中代谢物的组成。

2.6 蓝莓酵素的抗氧化活性分析

DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率、羟基自由基清除率和铁离子还原能力是抗氧化活性评价的常用参数。对蓝莓果汁酵素和蓝莓果渣酵素发酵前后抗氧化活性进行测定,结果见图4。蓝莓果汁、果汁酵素、果渣和果渣酵素对于DPPH自由基清除率的IC50分别为0.514、0.148、0.035和0.037%[见图4(a)],对于ABTS+自由基清除率的IC50分别为0.153、0.080、0.016和0.026%[见图4(b)],对于羟基自由基清除率的IC50分别为8.12、4.75、0.36和0.17%[见图4(c)]。蓝莓果汁在发酵后对DPPH、ABTS+和羟基自由基清除能力均有显著提升,其IC50分别下降了71.2%、47.7%和33.9%。这与Zhang等[41]的研究结果相一致,通过植物乳杆菌发酵后,蓝莓果汁中 DPPH、超氧阴离子自由基和羟基自由基的清除能力显著增强,Caco-2细胞模型中的氧化损伤也得到缓解。蓝莓果渣在发酵后对DPPH自由基清除能力的影响不显著,表明发酵处理后能够较好地保留原料中清除DPPH自由基的活性。但对ABTS+自由基清除率有所下降,这与果渣发酵过程中的微生物代谢偏好有密切关系。果渣中含有较多的纤维素及鞣酸等难以分解的物质,在发酵过程中微生物优先利用某些小分子的活性物质,从而造成了自由基清除能力的阶段性降低。该结果反映了发酵体系中不同碳源在微生物利用顺序上存在竞争关系。但蓝莓果渣酵素对羟基自由基清除能力有显著提升(IC50降了52.8%),主要原因可能是在乳酸菌发酵阶段黄酮含量的增加;而黄酮作为羟基自由基的有效清除剂,可极大地提高羟基自由基的清除率。同时,由于蓝莓果渣酵素中有机酸的含量显著高于果汁酵素,而某些有机酸(如乳酸、泛酸等)已被研究证实可发挥一定的协同抗氧化作用[42-43]。二者可能通过不同的机制协同淬灭羟基自由基,从而强化了果渣酵素的抗氧化活性。不同蓝莓原料发酵前后的铁离子还原力如图4(d)所示,果汁酵素中的铁还原力显著提升,但果渣酵素的还原能力有所下降。综合来说,连续接种发酵显著提高了蓝莓果汁酵素中3种自由基清除能力和铁离子还原力,但在蓝莓果渣酵素中只有羟基自由基清除能力有所提升。蓝莓果渣酵素部分活性成分损失,或与果渣酶解等制备工艺相关,不过蓝莓果渣酵素的抗氧化能力仍能保持较高的水平,其IC50均远低于蓝莓果汁酵素。

不同小写字母表示组间数据差异显著(P<0.05)。

图4 发酵前后蓝莓果汁酵素和蓝莓果渣酵素的抗氧化活性

Fig.4 Antioxidant activity of blueberry juice Jiaosu and blueberry pomace Jiaosu before and after fermentation

3 结 论

研究采用代谢组学技术,分析了酵母菌和植物乳杆菌连续接种发酵蓝莓果汁酵素和蓝莓果渣酵素中代谢物的变化,揭示了微生物发酵对蓝莓酵素生物活性成分和抗氧化活性的影响。双菌连续接种发酵显著提升了蓝莓酵素中总酚、总酸、γ-氨基丁酸含量和SOD活性。相较于未发酵的蓝莓原料,蓝莓果汁酵素的体外抗氧化能力均有显著提高,而蓝莓果渣酵素中仅有羟基自由基清除能力有显著增加。但综合来说,蓝莓果渣在发酵后仍保持较高的抗氧化活性,其IC50均远低于蓝莓果汁酵素。糖类和有机酸是发酵液中主要的代谢物种类。KEGG 注释和富集表明,蓝莓果汁发酵过程中主要涉及糖类化合物之间的互相转化,糖代谢是微生物显著改变蓝莓果汁酵素中代谢物组成的主要途径。而蓝莓果渣中含有较多的有机酸,因此除了糖类化合物的转化利用外,还涉及了不饱和脂肪酸的生物合成和乙醛酸盐和二羧酸盐代谢等。双菌连续接种发酵在不同的植物原料基质中表现出了不同的代谢转换途径,并且对提高不同蓝莓原料中的活性成分及抗氧化功效具有显著的促进作用。在连续发酵过程中,酵母菌与植物乳杆菌呈现时序性功能分工与协同效应。酵母菌主导发酵前期,其在有氧环境中快速繁殖产生CO2降低发酵液的pH值并初步分解基质,为后续发酵提供关键底物和良好环境。植物乳杆菌在发酵中后期成为主导菌株,通过同型乳酸发酵进一步产酸并稳定体系,并对前期释放的产物进行深度生物转化,从而共同优化了蓝莓酵素的最终代谢物谱与功能品质。这表明,连续接种发酵的生产工艺能够作为蓝莓产品开发的新选择。研究旨在阐明双菌连续接种发酵对蓝莓果汁与果渣中活性物质释放的促进机制,同时也为提升蓝莓全果利用率提供可行的发酵工艺方案。研究将传统加工中的副产物转化为富含活性代谢物的酵素产品,为实现蓝莓加工副产物的高值化利用开辟新的技术路径,希望推动蓝莓产业向资源全利用、附加值提升的可持续发展方向转型。后续研究可聚焦于不同原料生产工艺的影响及解析代谢调控网络的作用机制,以揭示关键菌群及相关活性物质的转化,从而实现蓝莓发酵产品质量与功效活性的提升。

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Effects of Sequential Inoculation Fermentation on Quality and Metabolite Profiles of Blueberry Juice Jiaosu and Blueberry Pomace Jiaosu

YAO Sha, CHEN Qiuhui, LI Xi’e, TANG Deyuan, CHEN Li*

(Guizhou Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biopharmaceutical/School of Liquor and Food Engineering, Guizhou University, Guiyang 550025, China)

Abstract： Majiang blueberry, a national geographical indication product of Majiang County in Qiandongnan Miao and Dong Autonomous Prefecture, Guizhou Province, has been widely supplied across China due to its superior quality. To improve comprehensive utilization rate of Majiang blueberry fruits and enhance release of bioactive substances, blueberry juice Jiaosu and blueberry pomace Jiaosu were prepared through sequential inoculation with Saccharomyces cerevisiae and Lactiplantibacillus plantarum. The effects of microbial fermentation on the substance transformation of blueberry Jiaosu were elucidated through metabolomics and KEGG pathway enrichment analysis. Additionally, product quality was evaluated by sensory evaluation and antioxidant activity. The results showed that sequential dual-strain fermentation significantly increased the contents of total phenols, total acids and γ-aminobutyric acid, as well as the activity of superoxide dismutase in both types of blueberry Jiaosu. A total of 152 metabolites were identified in both blueberry Jiaosu products before and after fermentation, with sugars and organic acids being the predominant metabolites. 49 differential metabolites (VIP≥1, P<0.05), including 19 sugars, 11 organic acids, 3 alcohols, 3 esters, and 9 other metabolites were screened between the two blueberry fermentates by orthogonal partial least squares-discriminant analysis. KEGG enrichment analysis indicated that carbohydrate metabolism was the primary conversion pathway altering the metabolic profile of blueberry Jiaosu, while fermentation of blueberry pomace additionally involved other major pathways, including unsaturated fatty acid biosynthesis and glyoxylate and dicarboxylate metabolism. After fermentation, blueberry juice Jiaosu exhibited significant improvements in all antioxidant activity indicators and received an overall sensory score of 83.70. In contrast, blueberry pomace Jiaosu demonstrated superior hydroxyl radical scavenging ability, with a 52.8% reduction in IC50, and achieved an overall sensory score of 72.20. It is expected that this study could provide theoretical references for the development of Majiang blueberry functional fermented products, as well as improve the comprehensive utilization rate and advance the intensive processing of Majiang blueberry fruits.

Keywords： Majiang blueberry; dual-strain fermentation; antioxidant activity; metabolomics; organic acids

doi：10.12301/spxb202500571

文章编号：2095-6002(2026)03-0055-13

引用格式：姚纱, 陈秋慧, 李溪娥, 等. 连续接种发酵对蓝莓果汁酵素和蓝莓果渣酵素品质及代谢物组成的影响[J]. 食品科学技术学报,2026,44(3):55-67.

YAO Sha, CHEN Qiuhui, LI Xi’e, et al. Effects of sequential inoculation fermentation on quality and metabolite profiles of blueberry juice Jiaosu and blueberry pomace Jiaosu[J]. Journal of Food Science and Technology, 2026,44(3):55-67.

中图分类号： TS255.3

文献标志码： A

收稿日期： 2025-11-28

基金项目： 贵州省科技创新人才团队建设项目(黔科合人才CXTD[2025]054);贵州省科技支撑计划项目(黔科合支撑[2019]2317)。

Foundation: Guizhou Province Science and Technology Innovation Talent Team Construction Project (Guizhou Science and Technology Talent CXTD[2025]054); Guizhou Provincial Science and Technology Support Plan (Guizhou Science and Technology Support [2019]2317) .

第一作者： 姚 纱,女,硕士研究生,研究方向为食品工程。

*通信作者： 陈 莉,女,副教授,主要从事功能性发酵食品研究。

(责任编辑：李 宁)