阿洛醇是一种具有较高应用价值的六碳稀有糖醇,具有低能量、温和降血压、抗肥胖等生理特点,对糖尿病及相关代谢性疾病具有潜在的预防与缓解作用[1-3]。在稀有糖/糖醇异构化转化策略中,阿洛醇可以作为D/L-型己糖之间的转化枢纽,实现D/L-阿洛酮糖和D/L-阿洛糖等高价值稀有糖的相互转化[4-6]。阿洛醇可以通过生物提取法、化学法、生物转化法获得。因阿洛醇在自然界中的含量极低,1 kg新鲜鼠刺叶片和485 g紫色粉孢牛肝菌中仅可提取出14 g和1.2 g阿洛醇,所以生物提取法无法满足工业化需求。采用化学方法可由D-葡萄糖电解还原制备阿洛醇,但此过程能耗高,需要严苛的反应条件并伴随大量副产物,这种方法既不环保又难以工业化应用[7-8]。在生物转化法制备阿洛醇的研究中,早期策略聚焦于两步酶法,通过构建共表达核糖醇脱氢酶(RDH)与甲酸脱氢酶(FDH)的工程菌,以D-阿洛酮糖为底物,经RDH还原生成D-阿洛醇,其中FDH负责辅因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的再生[9]。然而,由于D-阿洛酮糖成本较高,该策略难以实现规模化应用。为解决底物昂贵问题,已有研究在两步酶法的基础上通过引入D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(DPE),形成了以D-果糖为起点的多级酶联化体系,显著降低了底物成本[10]。也有研究者尝试以更为廉价的D-葡萄糖作为底物,通过葡萄糖异构酶(GI)和DPE级联催化葡萄糖经两步反应获得D-阿洛酮糖,最后通过还原反应生成阿洛醇[11]。以D-葡萄糖为底物进一步降低了底物成本,但反应涉及了4种酶,反应条件难以保证所有酶的活性,底物浓度也难以提高。因此以D-果糖为原料制备阿洛醇的生物催化途径,具有反应条件温和、转化率高、对环境友好且成本低等优势,正逐渐成为生物转化法产阿洛醇的主导技术路线[7]。

已有研究指出,产碱普罗威登斯菌(Providencia alcalifaciens)来源的核糖醇脱氢酶(PaRDH)作为一类表现较优的核糖醇脱氢酶,在催化阿洛酮糖还原方面具有良好活性,但其最适温度仅约为35 ℃[12]。在这一温度下,DPE的催化效率通常偏低,难以及时生成足量的D-阿洛酮糖,进而制约整体级联反应速率[13]。此外,全细胞反应若长期维持在35 ℃左右,在规模化生产中也更容易出现杂菌污染的问题,而引入抗生素会带来残留风险,增加后续分离纯化的环节与成本。因此,提高PaRDH的耐热性,使其能够在较高温度下稳定、高效地工作,是优化该级联反应体系的关键,而目前关于此方面研究较少。

此外,在生物合成领域,E. coli BL21(DE3)作为常用的重组表达宿主,已成为构建多酶级联体系和开展全细胞催化反应的核心底盘细胞[14]。与体外多酶反应相比,全细胞催化无须烦琐的蛋白纯化过程,能够显著降低生产成本;同时,酶在细胞内受天然环境保护,可保持更高的稳定性与活性,减少因温度、pH值或金属离子导致的失活风险[15]。并且,E. coli BL21 (DE3)具备良好的可溶性蛋白表达能力,能够高效共表达多个酶,使连续反应得以在同一细胞中顺利进行[16]。更重要的是,全细胞体系能够利用宿主固有或外源构建的辅酶再生体系,高效维持NADH/NAD+平衡,从而支持需要NADH参与的还原反应,避免因大量添加NADH导致成本过高[17]。因此,基于E. coli BL21 (DE3)的全细胞催化策略可为构建高效、经济和环境友好的生物制造体系提供重要技术优势。

本研究拟在改造提升PaRDH热稳定性的基础上,以共表达CcDPE、PaRDH、PseFDH的E. coli BL21 (DE3)为底盘细胞,构建以D-果糖为底物的阿洛醇全细胞催化制备体系,在低外源NADH添加的条件下,实现阿洛醇的高效生产。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验所用酶的来源:PaRDHVM (由实验室前期工作获得)来源于产碱普罗威登斯菌(Providencia alcalifaciens)、PseFDHA199G[18]来源于假单胞菌(Pseudomonas sp. 101)、CcDPED281G-C289R(由实验室前期工作获得)来源于解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum H10)。质粒构建宿主为E. coli JM109,蛋白表达宿主为E. coli BL21 (DE3)。

质粒抽提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒,北京天根生化科技有限公司;P0015L蛋白上样缓冲液(5×)、Bradford蛋白浓度试剂盒,上海碧云天生物技术股份有限公司;琼脂糖、溶菌酶、氨苄青霉素,上海生工生物工程股份有限公司;蛋白胶快速制备试剂盒,美国Bio-Rad公司;DNA分子量标准试剂,烟台市东盛生物科技有限公司;彩色预染蛋白分子质量标准试剂(8～180 kDa),上海翌圣生物科技股份有限公司;果糖,上海国药集团化学试剂有限公司;NADH,上海阿拉丁生化科技股份有限公司。实验所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

ProFleTM型PCR仪、Mini Protein Tetra型蛋白胶电泳仪、GelDoc-It型凝胶成像仪,美国Bio-Rad公司;ZQZY型空气振荡培养箱、ZQZY型水浴振荡培养箱,上海知楚仪器有限公司;UV-1800型紫外可见分光光度计,上海棱光仪器仪表厂;小型台式离心机,德国Eppendorf公司;SCIENTZ-IID型超声破碎仪,宁波新芝生物科技股份有限公司;1260型高效液相色谱仪,安捷伦科技上海有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 培养基及培养条件

LB液体培养基:10 g/L NaCl、5 g/L酵母粉、10 g/L蛋白胨。

LB固体培养基:在LB液体培养基中加入含有质量分数2%的琼脂粉制成。

TB液体培养基:24 g/L酵母粉、2.31 g/L KH2PO4、5 g/L甘油、12 g/L蛋白胨、12.54 g/L K2HPO4。

摇瓶种子液培养:取-80 ℃冷冻保藏的甘油管,化冻后按照体积分数为1‰的接种量接至10 mL的LB液体培养基中,而后在37 ℃、摇床转速为200 r/min的条件下培养8～10 h。

摇瓶发酵培养:将培养好的种子液转接到TB液体培养基中,接种量为5% (体积分数),在37 ℃、摇床转速为 200 r/min 的条件下培养1.5 h后,加入 0.1 mol/L 的异丙基-β-D-硫化半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂并将温度降至25 ℃继续培养24 h。

1.3.2 菌株构建

质粒pRSFDuet-1作为共表达载体,pET-24a(+)作为单独表达的载体,所有突变质粒通过定点突变构建(部分重叠的两条反向引物扩增目标质粒),并由苏州金唯智生物科技有限公司进行测序。本研究中使用的引物序列见表1。

表1 引物序列

Tab.1 Sequences of primers

引物序列(5′-3′)E129A-FCCTCATTTTATTGCACAGAAAAGCGGCGATGTGE129A-RTGCAATAAAATGAGGCAGCACTGCGCGCACA87V-FATATTTTTCATGTGAATGCGGGCGCATATATTGA87V-RCACATGAAAAATATCCAGGCGGCCCGCTTTCI93V-FGGGCGCATATGTGGGCGGCCCGGTGGCGI93V-RCACATATGCGCCCGCATTCGCATGAAAAATATCI148P-FTGGTGCCGGTGCCGTGGGAACCGATTTATACI148P-RCGGCACCGGCACCATGCCCGCAATGCTGCTTGM63S-FTGGTGGATCTGAGCAAACCGGAACAAGTGM63S-RGCTCAGATCCACCACCAGCGGAATCGCATTATCM63T-FTGGTGGATCTGACCAAACCGGAACAAGTGM63T-RGGTCAGATCCACCACCAGCGGAATCGCATTATCM199L-FCGAAAGAAAAACTGGAAGAAGCGCTGGCGM199L-RCAGTTTTTCTTTCGGCCAATCATCCAGCAGCGCS172A-FCCGCCAAGTGGCGCAGTACGGCGTTCGTGS172A-RCGCCACTTGGCGGCGTGTTGAATGCACAAACGT167L-FTTGTGCATTCACTGCGCCGCCAAGTGTCACT167L-RCAGTGAATGCACAAACGCTTGCACCGCN7G-FGAAGGCAAAGTGGCGGCGATTACCGGCN7G-RCCACTTTGCCTTCCAGGCTAATCGCCATT167M-FTTGTGCATTCAATGCGCCGCCAAGTGTCACT167M-RCATTGAATGCACAAACGCTTGCACCGC

1.3.3 酶活测定

1.3.3.1 RDH酶活及热稳定性测定

以pET-24a(+)为载体分别单独表达PaRDH(或突变体)和PseFDHA199G,宿主菌为E. coli BL21 (DE3)。分别制备浓度为15 OD600的PaRDH菌液与30 OD600的PseFDH菌液(离心收获菌体后用pH值为7.0的100 mmol/L HEPES溶液重悬至该浓度),破壁后得到PaRDH粗酶液和PseFDH粗酶液。

酶活测定体系(600 μL):100 μL PaRDH粗酶液、200 μL PseFDH粗酶液及300 μL底物(200 g/L的阿洛酮糖、2 mol/L的甲酸钠、3 mmol/L的NADH),于45 ℃反应30 min后沸水浴灭活,并通过HPLC定量产物。酶的热稳定性依据其在50 ℃孵育6 h后的残余酶活性进行评价,残余酶活测定方法与初始酶活测定方法一致。

1.3.3.2 FDH酶活及热稳定性测定

以pET-24a(+)为载体分别单独表达PaRDH和PseFDHA199G,宿主菌为E. coli BL21 (DE3)。分别制备浓度为15 OD600的PseFDH菌液与30 OD600的PaRDH菌液(离心收获菌体后用pH值为7.0的100 mmol/L HEPES溶液重悬至该浓度),破壁后得到PseFDH粗酶液和PaRDH粗酶液。

酶活测定体系(600 μL):100 μL PseFDH粗酶液、200 μL PaRDH粗酶液及300 μL底物(200 g/L的阿洛酮糖、2 mol/L的甲酸钠、3 mmol/L的NADH),于45 ℃反应30 min后沸水浴灭活,并通过HPLC定量产物。

1.3.3.3 DPE酶活及热稳定性测定

以pET-24a(+)为载体表达CcDPE,宿主菌为E. coli BL21 (DE3)。制备浓度为10 OD600的菌液(离心收获菌体后用pH值为7.0的100 mmol/L HEPES溶液重悬至该浓度),破壁后得到CcDPE粗酶液。

酶活测定体系(600 μL):300 μL CcDPE粗酶液和300 μL底物(200 g/L果糖、2 mol/L甲酸钠),于45 ℃反应15 min后沸水浴灭活,并通过HPLC定量产物。

1.3.4 全细胞催化制备阿洛醇

将共表达PaRDH、PseFDH与CcDPE的工程菌株于TB液体培养基中诱导培养24 h后收获,以果糖为底物生产阿洛醇的全细胞催化剂,催化制备阿洛醇的流程见图1。菌体经离心、弃上清液后,用1 mol/L甲酸钠溶液(pH值为6.0)重悬,并根据重悬菌液的OD600值计算所需细胞量。反应体系包含:100 g/L的果糖,0.75 mol/L或1.00 mol/L的甲酸钠,1.00 mmol/L的NADH。反应初始pH值为6.0,反应温度为 45 ℃(差异处将单独标注),反应细胞浓度在结果与分析部分具体说明。

图1 以D-果糖为底物制备阿洛醇流程

Fig.1 Flowchart for producting of allitol from D-fructose

1.3.5 突变位点选择

1.3.5.1 PROSS在线工具预测位点

PROSS是一种基于结构进化分析的算法,通过将目标蛋白的序列与结构同源物比对,在保持其功能位点不变的前提下,推荐可降低折叠自由能(ΔΔG)的氨基酸替换方案[19-20]。使用AlphaFold 3预测PaRDH的结构[21],并将结构提交至PROSS在线设计平台(http:∥pross.weizmann.ac.il)进行突变体的自动设计。

1.3.5.2 单点自由能预测

折叠自由能是评估蛋白质热稳定性的核心热力学参数,其变化量(ΔΔG)可直接反映突变对酶稳定性的影响:ΔΔG负值表明突变增强稳定性,正值则削弱稳定性。在酶热稳定性设计中,折叠自由能计算作为理性设计的关键工具,通过预测突变效应指导实验优化。为指导PaRDH的理性改造,本研究使用Rosetta软件进行了全残基单点突变自由能分析,对每个残基的20种可能替换计算ΔΔG。

1.3.5.3 保守性位点分析

为基于序列保守性指导理性设计,从NCBI (National Center for Biotechnology Information, https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)蛋白质数据库中对目标酶进行同源序列的广泛收集。检索获得与目标酶氨基酸序列一致性大于60%的同源序列共100条,以确保后续分析的生物学代表性与统计可靠性。这些序列经整理后,使用MEGA7软件进行多序列比对(multiple sequence alignment, MSA)。比对结果进一步通过WebLogo网页工具进行可视化,以精确展示每个氨基酸位点在进化过程中的保守性特征[22]。

1.3.6 分子动力学模拟

在温度为323 K的条件下对PaRDH及其突变体的模拟结构开展分子动力学(MD)模拟分析。将蛋白结构置于TIP3P水盒子中,蛋白表面与溶剂边界距离为10 Å,采用Amber ff14SB力场,添加Na+和Cl-中和系统电荷[23-24]。

能量最小化分两步进行:第一步,对蛋白主链施加约束(418.4 kJ·mol-1·Å-2)进行5 000步最小化(4 000步最速下降法、1 000步共轭梯度法)。第二步,解除所有位置限制,继续执行5 000步无约束能量最小化。随后在NVT系综下将系统逐步加热至323 K,再在NPT系综(101.325 kPa)下进行500 ps密度平衡,使体系达到热力学稳定状态。

生产模拟时长100 ns,时间步长2 fs,非键相互作用截断值10.0 Å,采用SHAKE算法约束所用含氢原子的键长;非键相互作用截断半径为10.0 Å,长程静电相互作用采用Particle Mesh Ewald(PME)算法计算。模拟轨迹利用AmberTools中的cpptraj模块进行后处理,计算蛋白质骨架原子的均方根偏差(RMSD)与残基均方根波动(RMSF);蛋白质三维结构采用PyMOL软件进行可视化绘制。

1.3.7 检测方法

通过测量600 nm处的光密度(OD600)估计细胞密度。通过SDS-PAGE分析重组酶的表达。D-果糖、D-阿洛醇、D-阿洛酮糖和D-山梨糖醇的浓度通过HPLC用Aminex HPX 87 C柱(7.8 mm×300 mm, 9 μm)测量。以ddH2O为流动相,并以0.6 mL/min的流速进行分析,柱温箱温度为80 ℃,折射率检测器(RID)温度为50 ℃[17]。

1.4 数据处理

所有数据均使用GraphPad Prism(版本号:9.5.0)软件进行统计分析。首先对数据进行正态性检验(Shapiro-Wilk检验)和方差齐性检验。数据以平均值±标准偏差(Mean±SD)表示。多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),随后采用Dunnett’s 多重比较检验(Dunnett’s multiple comparisons test)将各实验组分别与对照组进行比较。以 P<0.05表示具有统计学意义。每组实验数据均重复3次。

2 结果与分析

2.1 重组全细胞催化剂构建结果分析

底盘菌株由实验室前期工作获得,共表达了来源于纤维素梭菌(Clostridium cellulolyticum H10)的CcDPE[13]、来源于产碱普罗威登斯菌(Providencia alcalifaciens)的PaRDH[12]以及来源于绿脓杆菌(Pseudomonas sp. 101)的甲酸脱氢酶PseFDH[25]。图1中,CcDPE催化D-果糖转化为D-阿洛酮糖,D-阿洛酮糖在PaRDH与PseFDH的协同作用下被还原为阿洛醇。此过程中,PseFDH负责完成辅因子NADH的再生。

2.2 单点突变体设计、表征及分析

本研究综合运用了PROSS在线预测、Rosetta能量计算以及保守性分析等多种理性设计策略,针对PaRDH进行了稳定性优化,热稳定性设计结果见图2。通过PROSS在线预测获得潜在突变体N7G、I148P、T167M。由图2(a)可见,使用Rosetta软件进行全残基虚拟饱和突变,筛选出折叠自由能大幅降低的M63S、M63T、T167L和M199L。图2(b)显示,基于NCBI同源酶比对分析,选定不严格保守位点E129A、S172A、I93V,同时设计A87V以减少Loop区柔性。

图2 RDH热稳定性突变位点设计

Fig.2 Selection of mutation sites for RDH thermostability

将PaRDH突变体构建于pET-24a(+)载体,以E. coli BL21 (DE3)为宿主,培养后收获菌体破壁得到酶液,与PseFDH复配测其活性,分析结果见图3。由图3可知,所有突变体的初始酶活都没有出现大幅度降低,这可能是由于突变位点未涉及酶活性中心,对酶表达水平和活力影响不大,其中与模板PaRDHVM相比突变体N7G、T167M、M63S、M63T、I93V、E129A的酶活更高,提升最明显的N7G初始酶活为11 625 U/mL,与模板PaRDHVM的酶活10 271 U/mL相比提升了13.18%。在热稳定性方面,除I93V外,所有突变体经50 ℃热孵育6 h后的酶活残留率均高于模板PaRDHVM的酶活残留率(52.04%);其中最突出的是A87V,酶活残留率为91.08%,但其摇瓶发酵初始酶活仅为8 994 U/mL,低于模板PaRDHVM酶活;而突变体N7G热孵育后的酶活残留率为79.84%,是除A87V以外热稳定性最好的单点突变体。

*表示与PaRDHVM比较(写作VM)突变体的初始酶活和残留酶活差异显著(P<0.05)。

图3 单点突变体酶学性质测定

Fig.3 Enzymatic properties of single point mutants

图4为突变体稳定性提升的机制分析结果。图4(a)展示了所有对热稳定性有提升的突变位点,为了分析各单点突变之间可能存在的协同或拮抗作用,本研究将突变后的序列进行结构预测,分析了各单点突变体提升稳定性的可能机制。图4(b)至(f)展示了突变体热稳定性提升可能的机制。由图4(b)可见,N7突变成甘氨酸(N7G)后导致邻近的β-折叠缩短了一个残基,推测β-折叠缩短一个残基后能更紧密地被周围4个α-螺旋“包围”,并且降低了局部张力。图4(c)中,T167的侧链羟基能够与F163的主链羰基形成竞争性氢键,从而干扰该区域原有的主链氢键模式并削弱局部α-螺旋的稳定性。将该位点突变为甲硫氨酸(T167M)后,由于侧链羟基被去除,竞争性氢键不再形成,进而增强了该区域α-螺旋的构象稳定性[26];T167L增强稳定性的原因可能与T167M相似,亮氨酸同样比苏氨酸更易形成稳定螺旋结构,其疏水侧链可与邻近α-螺旋的残基形成更紧密堆积,从而增强局部结构稳定性。图4(d)中,M63位于蛋白表面柔性Loop区域,甲硫氨酸侧链较长且疏水性较高,替换为较短且亲水的丝氨酸(M63S)或苏氨酸(M63T)可以降低局部柔性并改善表面与溶剂的相互作用,因此稳定性提升。由于苏氨酸侧链带有额外甲基,限制了Loop区域的柔性,所以M63T的稳定性高于M63S。由图4(e)可见,I148突变成脯氨酸(I148P)可以限制β-转角在高温下的扰动,进而提升稳定性。图4(f)中,E129突变成丙氨酸(E129A),突变消除了蛋白表面的局部高正电荷区,从而优化了整体的静电平衡。某一区域的RMSF波动值通常可以反映蛋白的热稳定性,波动值越小代表热稳定性越好。图4(g)的突变体分子动力学模拟结果表明,这些突变体整体的RMSF波动值小于模板PaRDHVM,尤其是在第100、150、170、200个残基处的波动减小更为明显。这揭示了突变体热稳定性增强的分子基础。

“→”表示RMSF值显著降低区域。

图4 突变体热稳定性提升的机制分析

Fig.4 Mechanism analysis of mutant thermostability enhancement

2.3 组合突变体的设计、表征及分析

不同突变体可能存在协同效应(正协同或负协同),所以在叠加时往往要选择合适的策略。因为N7G突变体具有较高初始酶活和较高的热稳定性:N7G的初始活性为11 625 U/mL,比模板PaRDHVM的酶活(10 271 U/mL)高13.18%;在50 ℃下热孵育6 h的酶活残留率为79.84%,远高于模板PaRDHVM 的酶活残留率(52.04%)。并且考虑到N7G位于游离N-端,对整体结构影响较小。因此,本研究以N7G为新一轮叠加突变的模板,通过引入其他单点突变,构建了10株性能均得到显著提升的双突变。图5为组合突变体的酶学性质分析结果。图5(a)显示,所有突变体热孵育残留率均在80%以上,其中突变体N7G-I93V的初始酶活最高,达到13 422 U/mL,为模板PaRDHVM酶活的130.68%,极大提升了酶的性能。此外,突变体N7G-I93V的热稳定性显著提升,在50 ℃条件下的半衰期为16.26 h,远高于模板PaRDHVM的半衰期(7.66 h)。另外得到一株热稳定性提升明显,但初始酶活略微下降的突变体N7G-I148P。突变体N7G-I148P在50 ℃条件下的半衰期为25 h,是模板PaRDHVM半衰期的3.25倍,但初始酶活下降至8 783 U/mL,为模板PaRDHVM酶活的85.51%。

*表示与PaRDHVM比较(写作VM)突变体的初始酶活和残留酶活差异显著(P<0.05)。

图5 组合突变体酶学性质

Fig.5 Enzymatic properties of combinational mutants

图3结果显示,I93V突变提高了酶的催化活性,N7G突变同时提高了酶活性和热稳定性,而I148P突变在提升热稳定性的同时,降低了初始酶活。在组合突变体中,这些单点突变效应呈现出叠加特性。突变体N7G-I93V在活性上获得了远超单点的提升,且未降低其稳定性;而突变体N7G-I148P则实现了热稳定性的组合式增强。图5(c)的动力学模拟结果证明,突变体N7G-I93V和N7G-I148P的RMSF波动值要小于模板PaRDHVM,佐证了稳定性提高的原因。

2.4 突变体在全细胞催化体系中的应用结果分析

为评估其实际应用效果,将突变体PaRDHVM-N7G-I93V和PaRDHVM-N7G-I148P分别构建于三酶共表达体系,所得工程菌命名为Ec/DRF-Therm-VMGV和Ec/DRF-Therm-VMGP,在图6中分别简称为VMGV和VMGP。携带PaRDHVM(对照菌)的工程菌命名为Ec/DRF-D2-R(VM)-F(G),在图6中简称为VM。

图6 突变体在全细胞催化制备阿洛醇中的应用

Fig.6 Application of mutants in whole-cell catalytic production of allitol

图6(b)的全细胞催化结果显示,在细胞加量为5 OD600的条件下,与对照菌株Ec/DRF-D2-R(VM)-F(G)相比,菌株Ec/DRF-Therm-VMGV于45 ℃条件下的转化率有所提升。随后在42.5 ℃和47.5 ℃的实验中,菌株Ec/DRF-Therm-VMGV的转化率同样高于对照菌株。其中图6(c)显示,在47.5 ℃条件下突变体的优势更加明显,但最终转化率不如45 ℃,这可能与体系中其他2个酶的稳定性有关。但菌株Ec/DRF-Therm-VMGP仅在47.5 ℃条件下反应时,比对照菌株有轻微优势,这可能与其发酵酶活相对偏低有关。因此,本研究选择Ec/DRF-Therm-VMGV作为最终的全细胞催化菌株。

图6(d)和(e)显示,当提高反应细胞加量至10 OD600后,菌株Ec/DRF-Therm-VMGV在45 ℃条件下反应24 h的阿洛醇转化率达到79.43%,比对照菌株的转化率高4.10%,展现出一定优势。HPLC结果显示,反应后期体系内的甲酸钠几乎被消耗殆尽。作为PseFDHA199G的底物,甲酸钠的含量直接关系到辅因子NADH的再生。于是将甲酸钠的添加量从最初的0.75 mol/L提高至1.00 mol/L,以此提升后期反应的动力。如图6(f)所示,在提高甲酸钠浓度之后,当细胞加量为15 OD600时,反应12 h和24 h的阿洛醇转化率分别达到83.10%和90.45%。该转化率高于Zhu等[27]报道的54.02%(以90 g/L的果糖为底物),和Wen等[10]报道的63.44%(以100 g/L的果糖为底物),与Wang等[17]报道的90%转化率接近(以90 g/L的果糖为底物),但本研究在产量上更高。

尽管如此,PaRDHVM热稳定性提升对阿洛醇的整体转化率并不是特别显著,推测体系中或有其他限制性因素。1)非限速性。在优化的全细胞环境中,即使PaRDHVM在45 ℃下稳定性欠佳,其现有的活性与稳定性水平已足以使其在反应过程中不再构成限速步骤。因此进一步提升其热稳定性无法带来额外收益。为了验证这一猜想,本研究测量了CcDPED281G-C289R和PseFDHA199G在45 ℃条件下的酶活衰减速度。图6(h)显示,CcDPED281G-C289R热孵育24 h后的酶活性大幅度下降,仅为初始酶活的16.51%,CcDPED281G-C289R活性的下降极可能导致果糖到阿洛酮糖的转化受阻,因此这可能是限制PaRDHVM热稳定性突变体在整个全细胞转化体系中效果的原因。2)系统复杂性。全细胞体系内部的物理屏障与分子伴侣等,可能为内源酶提供了一定的保护作用,从而部分补偿了PaRDH本身的热不稳定性。

3 结 论

随着稀有糖需求的不断增长,构建高效且经济的阿洛醇生物合成体系已成为近年来的研究重点。通过多种策略改造PaRDH的热稳定性,旨在为阿洛醇的工业生产获得性能更优的PaRDH。本研究经第一轮筛选获得了11株性能提升的单点突变体,进一步组合突变获得了热稳定性显著提高的优势突变体PaRDHVM-N7G-I93V,其酶活为13 422 U/mL,是模板PaRDHVM酶活的130.68%。在50 ℃条件下的半衰期为16.26 h,远高于模板PaRDHVM的半衰期(7.66 h)。在以100 g/L果糖为底物的全细胞催化体系中,应用突变体PaRDHVM-N7G-I93V制备阿洛醇,反应24 h后,阿洛醇转化率达90.45%。该转化率高于Zhu等[27]和Wen等[10]报道的转化率,与Wang等报道的90%转化率接近[17],但本研究的细胞添加量比他们更少,并且在产量上更高。本研究构建的全细胞催化体系实现了相对更高的阿洛醇转化效率与产量,显著提升了全细胞催化合成阿洛醇的综合性能,希望为其工业应用奠定更坚实的基础。

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Thermostability Engineering of Ribitol Dehydrogenase and Its Application in Whole-Cell Catalytic Production of Allitol

LI Zhihao, WU Jing, XIA Wei*

(School of Biotechnology/Key Laboratory of Ministry of Education for Industrial Biotechnology,Jiangnan University, Wuxi 214122,China;State Key Laboratory of Food Science and Resources, Jiangnan University,Wuxi 214122, China)

Abstract： Allitol is a six-carbon rare sugar alcohol with physiological activities such as antihypertensive and anti-obesity effects, holding application value in the functional food and pharmaceutical industries. Currently, whole-cell catalysis for allitol production is still limited by relatively low reaction temperatures. Ribitol dehydrogenase (PaRDH), which catalyzes the reduction of psicose to allitol, typically functions optimally under low to moderate temperature conditions, which not only reduces conversion efficiency but also increases process risks such as microbial contamination. To enhance the application performance of PaRDH, multiple strategies including PROSS web-based prediction, free energy analysis, and conserved site analysis were employed to systematically modify the thermostability of PaRDH. In the first round of mutagenesis, 11 mutants with improved performance were obtained. After another round of combinatorial mutagenesis, 10 mutants with significantly enhanced thermostability were generated. Among them, the initial enzyme activity of mutant PaRDHVM-N7G-I93V increased by 30.68% compared to the template PaRDHVM, and its half-life was extended from 7.66 h to 16.26 h. This mutant was then introduced into a three-enzyme cascade system, and the resulting engineered strain was designated as Ec/DRF-Therm-VMGV. Using a cell dosage of 10 OD600 at 45 ℃ for 24 h, the allitol conversion rate reached 79.43%, which was 4.10% higher than that of the control strain harboring PaRDHVM. Subsequently, the concentration of sodium formate in the reaction system was optimized and increased from 0.75 mol/L to 1.00 mol/L. Finally, using the engineered strain Ec/DRF-Therm-VMGV as the catalyst at a cell concentration of 15 OD600, the allitol conversion rates reached 83.10% and 90.45% after 12 h and 24 h of reaction, respectively, representing the highest levels reported to date. This study aimed to provide a theoretical reference for improving the production efficiency of allitol and promoting its industrial application.

Keywords： allitol; whole-cell biocatalysis; multi-enzyme cascades; ribitol dehydrogenase; thermostability engineering

doi：10.12301/spxb202500612

文章编号：2095-6002(2026)03-0044-11

引用格式：李志浩, 吴敬, 夏伟. 核糖醇脱氢酶热稳定性改造及其在全细胞催化制备阿洛醇中的应用[J]. 食品科学技术学报,2026,44(3):44-54.

LI Zhihao, WU Jing, XIA Wei. Thermostability engineering of ribitol dehydrogenase and its application in whole-cell catalytic production of allitol[J]. Journal of Food Science and Technology, 2026,44(3):44-54.

中图分类号： TS201.3; Q814.9

文献标志码： A

收稿日期： 2025-12-22

基金项目： 国家重点研发计划项目(2024YFF1106300)。

Foundation: National Key Research and Development Program of China (2024YFF1106300).

第一作者： 李志浩,男,硕士研究生,研究方向为功能糖醇的生物合成。

*通信作者： 夏 伟,男,副研究员,博士,主要从事功能性糖醇生物法制备研究。

(责任编辑：叶红波)