根据GB/T 17204—2021《饮料酒术语和分类》规定,酒精饮料是指乙醇含量不低于0.5%vol的饮品。随着消费升级趋势的持续深化,现代消费者对饮品的要求已不再局限于基本饮用功能,而是更加注重健康属性和感官体验[1]。苦味是酒精饮料配方开发中面临的主要感官难题,近年来针对酒精饮料中挥发性苦味物质的鉴定和相应的苦味抑制方法逐渐成为研究热点。例如,Luo等[2]研究了采用气相色谱-质谱联用仪(gas chromatography-mass spectrometer, GC-MS)结合感官评价的方法对酱香型白酒中的挥发性苦味物质进行感官分析,发现1-丙醇、1-丁醇、2-甲基丙醇、3-甲基丁醇、2-苯乙醇、糠醛、5-甲基-2-糠醛、乳酸乙酯是酱香型白酒中的挥发性苦味物质。Wang等[3]采用夹鼻夹和不夹鼻夹的感官评价方式,结合GC-MS发现,芳樟醇、香芹酮、香叶醇、葎草烯、石竹烯、月桂烯及芳香族酚类衍生物是啤酒的挥发性苦味物质。

人类对苦味物质的化学感知主要由Ⅱ型味觉受体(type 2 taste receptors,TAS2Rs)介导,也称为苦味受体,该受体家族隶属G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)家族[4]。目前已确认了25种TAS2Rs受体,但是不同苦味受体在配体识别能力及响应特征方面存在明显差异,依据其对苦味物质识别范围的广泛程度,可将苦味受体划分为广谱识别型和相对特异识别型两类[5]。TAS2Rs能够和不同结构类型的苦味化合物结合并形成苦味感知,既包括结构复杂的非挥发性物质,也涵盖低分子量的挥发性物质;当受体被激活后,可通过G蛋白介导的信号转导途径诱导细胞内Ca2+水平升高,进而触发苦味信号的产生[6]。因此,苦味受体不仅构成解析苦味感知机制的重要分子基础,也为从受体层面阐释苦味抑制及调控效应提供了理论支撑。

葡萄糖基甜菊糖苷(glucosylated steviol glycosides, GSG)是通过对甜菊糖苷进行酶促转糖基化反应获得的衍生物,因其优异的风味改善特性和功能多样性而受到广泛关注[7-8]。与天然甜菊糖苷相比,GSG在结构上引入了额外的葡萄糖基团,这种结构修饰改变了其与人类苦味受体的结合方式,可显著降低苦味和金属余味,同时改善甜味质量,从而提升了整体的感官接受度[9]。近期的研究表明,GSG在抑制酒精饮料的非挥发性物质的苦味和改善风味品质方面具有显著优势,但其对挥发性苦味物质的感官调控作用及潜在分子机制仍缺乏深入阐明[10]。目前,针对酒精饮料挥发性苦味物质的鉴定和风味调控研究相对有限,通常采取GC-MS结合感官评价的方法进行,很少从受体水平解释其苦味感知的分子机制[2-3]。鉴于GSG对酒精饮料苦味抑制的感官结果,我们推测其对饮料中的挥发性苦味物质也可产生抑制作用,因此揭示GSG对酒精饮料中挥发性苦味物质的释放行为及其介导苦味物质与苦味受体相互作用,可为其对挥发性苦味的抑制作用及分子机制提供重要参考。

本研究以前期建立的自制酒精饮料体系为研究对象[10],利用顶空固相微萃取-气相色谱-嗅闻-质谱联用技术(headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-olfactometry-mass-spectrometer, HS-SPME-GC-O-MS)对酒精饮料中挥发性化合物的香气活力值进行测定,从而筛选出关键香气成分,并进一步评估GSG添加后对挥发性组分释放行为的影响。在此基础上,通过分子对接分析并结合感官评价方法,对酒精饮料中的挥发性苦味物质进行鉴定,同时解析其与人类苦味受体TAS2R14之间的相互作用特征。通过感官实验进一步验证GSG对这些挥发性苦味物质苦味感知的抑制作用。最后利用分子动力学模拟(molecular dynamics simulation, MD)从受体层面分析了挥发性苦味物质与人类苦味受体TAS2R14的相互作用特征及添加GSG的竞争性调控机制。通过系统探讨GSG对酒精饮料中挥发性苦味物质的抑制作用及其分子机制,旨在从化学分析、感官响应与分子机制3个层面,为酒精饮料挥发性苦味的调控提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

GSG(型号MS700)、赤藓糖醇、柠檬酸钠、柠檬酸、甜菊糖苷、伏特加香精、朗姆香精,诸城市浩天药业有限公司;食用酒精(酒精度≥ 96.0% vol),河南汉永酒精有限公司;邻二氯苯,国药集团上海有限公司;正构烷烃C7～C30,美国Sigma-Aldrich公司;辛酸乙酯、棕榈酸乙酯、苯甲醇、异戊醇、辛酸、糠醛、苯甲醛,色谱纯(纯度≥ 99.5%),上海麦克林生化科技有限公司;辛酸乙酯、棕榈酸乙酯、苯甲醇、异戊醇、辛酸、糠醛、苯甲醛,食品级(纯度≥ 99.5%),上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

FA1603C型电子天平(精度到0.001 g),上海天美天平仪器有限公司;ODP-4型嗅闻仪,哲斯泰(上海)贸易有限公司;8860-5977B型GC-MS仪[配置5975c型质谱仪、HP-INNOWAX型色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)及SPME纤维头(DVB/C-WR/PDMS/10, d.gray-3/pk)]、20 mL顶空进样瓶,美国Agilent科技(中国)有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 酒精饮料香气化合物的测定方法

1.3.1.1 模拟酒精饮料的制备

参考市售的某酒精饮料配制方法,建立模拟酒精饮料体系为研究对象[10]。

准确称量赤藓糖醇30 g,柠檬酸钠0.4 g于烧杯中,加蒸馏水125.81 g,置于50 ℃水浴中搅拌至完全溶解。而后加入柠檬酸1.2 g, 甜菊糖苷0.14 g,搅拌至无颗粒。将溶液冷却至室温,加入食用酒精42 g。准确称量伏特加香精0.3 g,朗姆香精0.15 g于烧杯中,搅拌混合均匀。最后加入碳酸水,定容到1 000 g,灌入无菌汽水瓶。

1.3.1.2 酒精饮料中的挥发性物质的测定方法

酒精饮料中的挥发性物质参考文献[11]的方法,采用HS-SPME-GC-O-MS对空白酒精饮料与加入GSG的酒精饮料分别进行分析测定。

HS-SPME条件:将SPME纤维头在GC进样器以1.0 mL/min的载气流速预处理30 min,将5 g样品密封在20 mL顶空样品瓶中,加入20 μL邻二氯苯的丙酮溶液(质量浓度100 mg/L)作为内标,并以400 r/min的速度搅拌;在50 ℃水浴中平衡10 min后,将老化的SPME纤维头悬浮在样品上方1.6 cm处吸附40 min,并在250 ℃下在GC进样器中解吸5 min。

GC-MS条件:使用氦气(纯度99.999%)作为载气,流速为2.0 mL/min;柱温箱最初在40 ℃下保持6 min,然后以3 ℃/min的速率升温至100 ℃ ,最后以5 ℃ /min的速率升温至230 ℃并持续10 min;质量选择检测器的电子电离能为70 eV,选择m/z范围为30～450 u的总离子流进行记录。

GC-O分析条件:升温程序同GC-MS,传输线温度250 ℃。嗅闻方法:为确保实验结果的一致性及准确性,GC-O嗅闻由3名对香原料熟悉、经过专业培训的感官嗅闻人员组成,采用香气强度法进行嗅闻定性:香气强度按照5分制打分(0表示嗅闻不到,1表示香气微弱,2表示香气中等,3表示香气较强,4表示香气强烈),嗅闻人员在打分的同时记下香气描述,最终将2位及以上嗅闻人员所闻到的香气进行整理记录。

1.3.1.3 挥发性物质的定性、定量及香气化合物的测定方法

将HS-SPME-GC-O-MS分析中的各组分数据与NIST 20谱库进行匹配,并通过保留指数(retention index, RI)值对化合物进行定性分析。挥发性化合物以邻二氯苯为内标物采取内标法进行定量,筛选的挥发性苦味物质通过外标法进行定量分析。酒精饮料中的关键香气化合物经过香气活力值(odor activity value, OAV)计算来确定,其中OAV为化合物浓度与其在水溶液中阈值的比值,阈值查找见参考文献[12],OAV>1的物质被认为对特征香气有贡献,OAV越大越有可能成为关键香气化合物。

1.3.2 酒精饮料挥发性苦味物质的鉴定方法

分子对接能够通过预测候选化合物与TAS2Rs之间的配体-受体相互作用关系,为苦味成分的高效识别提供一种可靠的理论工具。研究使用分子对接技术,确定酒精饮料中的挥发性苦味物质。在酒精饮料挥发性苦味物质鉴定中,分子对接采用AutoDock Vina 1.2.5软件进行,对接过程中使用半柔性对接策略,即受体蛋白保持刚性,而配体分子允许构象自由变化,从而更真实地模拟其与受体结合时的动态特征。

对接网格盒的中心坐标设置为x=135.498、y=129.202、z=144.864,网格间距为1.0 Å,并在x、y和z方向上均设定为126的尺寸范围[10]。由于TAS2R14受体具备广泛的配体识别谱,通常被认为是苦味筛查和表征的理想靶点[13],因此研究中选择其作为挥发性苦味物质鉴定进行分子对接的受体。配体的选择中,先基于HS-SPME-GC-O-MS检测的挥发性化合物结果,结合文献报道的信息初步筛选挥发性苦味物质,然后通过苦味物质(配体)与TAS2R14苦味受体进行对接,进一步确认,当配体与受体的结合能小于0 kcal/mol时,说明对接效果可行[14-15]。对接完成后,对所得结合构象进行系统评估,筛选出结合能最优且构象合理的姿态用于进一步分析。最终的分子对接结果通过PyMOL软件进行可视化展示,以直观呈现配体与受体之间的相互作用特征。

1.3.3 GSG对挥发性苦味物质苦味感知的测定方法

为评估GSG对酒精饮料中挥发性苦味物质苦味强度的影响,考虑酒精饮料中的水含量达80%以上,因此以水为基质进行了评估。首先,将鉴定出的各挥发性苦味物质标准品,分别配制成与其在酒精饮料中浓度相等的水溶液。再将这些单一物质的水溶液混合,以此混合物作为对照溶液。然后,在配制的各溶液中添加GSG并通过感官评价对添加前后样品的苦味强度进行比较分析,经优化后确定的添加浓度为50 mg/L。感官评价小组成员的筛选参照文献[10]的方法进行。同时,采取9点打分法对各样品进行苦味强度打分,苦味强度参考硫酸奎宁体系[16],强度分数见表1。在感官测试过程中,评估者需使用无味矿泉水对口腔进行充分冲洗,并在相邻样品之间设置不少于5 min的间隔时间,以降低感官适应和疲劳对结果的干扰。此外,为确保感官评价数据的独立性和客观性,在整个测试过程中严格禁止小组成员之间进行任何形式的交流[17]。

表1 硫酸奎宁苦味强度参比体系

Tab.1 Quinine sulfate bitterness intensity reference system

物质ρ/ (g/L)苦味强度分数0.059硫酸奎宁0.02550.011

1.3.4 GSG对挥发性苦味物质抑制的分子动力学分析方法

使用TAS2R14受体蛋白分别与鉴定出的重要挥发性苦味物质及GSG的主要成分——莱鲍迪苷A(rebaudioside A)[18]进行分子动力学模拟(molecular dynamics simulation, MD),从受体层面分析GSG对挥发性苦味物质抑制机制。

蛋白质采用Amber14sb力场,配体采用Gaff2力场,并利用TIP4P水模型为蛋白-配体体系添加溶剂,同时构建边长为1.2 nm的周期性水盒。长程静电相互作用通过粒子网格Ewald(PME)方法进行计算,并采用蒙特卡罗离子放置策略引入适量的Na+和Cl-,以中和系统总电荷。在开展正式MD之前,采用分阶段策略对体系进行能量优化与平衡处理。具体过程如下:首先,利用最速下降法对各体系进行能量最小化,迭代步数设为50 000,以消除初始构型中的不合理接触。随后,在粒子数和体积保持不变的条件下,于310 K的恒温环境中进行 50 000步预平衡模拟,积分步长为2 fs。接着,在粒子数恒定的前提下,引入1 bar(1×105 Pa)的恒定压力并维持体系温度为310 K,再进行50 000步、时间步长同为2 fs的预平衡计算。完成能量最小化与平衡步骤后,在无任何约束条件下,以2 fs的时间步长对体系进行100 ns的MD,并每隔10 ps记录一次构型坐标。通过分析MD轨迹,对复合物的均方根偏差、均方根波动、回转半径、蛋白-配体之间氢键数量及平均结合自由能进行了系统对比与评估[19]。

1.4 数据处理

通过Origin 2025软件绘制酒精饮料挥发性物质韦恩图,含量柱状图及聚类热图。使用Gromacs 2024.4软件进行MD。通过SPSS 27软件对感官评价结果进行单因素方差分析,当P<0.05时,判定处理组之间差异具有统计学意义,每种样品重复测试3次。

2 结果与分析

2.1 自制酒精饮料挥发性物质的GC-O-MS分析结果

在空白酒精饮料中一共检测出40种挥发性物质,加入GSG后检测出14种,检测结果见附录附表1。由附录附表1可知,在所有检测出的挥发性物质中,含有酯类11种,醇类9种,酸类4种,萜烯类6种,醛类8种,其他类3种。分析GSG对酒精饮料挥发性化合物的影响,实验结果见图1。空白酒精饮料及加入GSG后的挥发性物质的检出数量见图1(a)。由图1(a)可知,有13种物质在2个样品中都存在。酯类物质是酒精饮料中的最主要的成分[20],也是本研究中含量占比最大的挥发性化合物类型,加入GSG后挥发性物检出种类的影响结果见图1(b)。由图1(b)可见,酯类物质加入GSG后在气相中的含量显著降低(P<0.001),其他类型的挥发性化合物也产生了含量降低的结果,仅有1个挥发性化合物(月桂酸)在加入GSG后出现了含量升高的情况。这些结果表明,添加GSG能有效地调节部分挥发性物质的释放。

图1 GSG对酒精饮料挥发性化合物的影响
Fig.1 Effect of GSG on volatile compounds in alcoholic beverages

OAV是反映挥发性化合物香气贡献的重要参数,因此将OAV值取常用对数绘制了酒精饮料添加GSG前后各挥发性物质OAV值的差异热图,见图1(c)。由图1(c)可知,空白酒精组各物质OAV普遍高于加入GSG组,且OAV较高的普遍为酯类物质,如辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸异戊酯等。在空白酒精饮料样品中,OAV>1的挥发性物质有11种,其香气描述源自Flavornet[21]和Chemicalbook[22]数据库,并结合GC-O嗅闻的香气特征,包括:辛酸乙酯(果香、白兰地酒味)、癸酸乙酯(含坚果和似白兰地酒香气)、正己酸乙酯(菠萝、香蕉水果香气)、乙酸异戊酯(香蕉果香)、芳樟醇(柑橘花香甜玫瑰气味)、异戊醇(轻微酒精气味)、桉叶油醇(桉树、草药、樟脑味)、月桂烯(强烈的果香和花香)、(+)-柠檬烯(柑橘香)、庚醛(甜杏、 坚果香气)、柠檬醛(柠檬香),这些挥发性化合物可能是酒精饮料的关键香气物质,共同诠释了酒精饮料独特的香气特征。添加GSG后,各挥发性成分的OAV普遍显著下降,特别的是,仅月桂酸的OAV上升,且OAV>1,该成分呈现了低脂肪椰子湾油气味的香气特征。

2.2 自制酒精饮料中挥发性苦味物质的鉴定结果

经过GC-O测试发现自制的酒精饮料挥发性物质中,共有7种物质嗅闻结果为具有苦味特性,与文献对比,这些物质在不同酒精饮料苦味物质研究中同样被鉴定为挥发性苦味物质,分别为辛酸乙酯[16]、棕榈酸乙酯[23]、苯甲醇[24]、异戊醇[25]、辛酸[16]、糠醛[26]及苯甲醛[27]。将挥发性苦味物质与TAS2R14苦味受体进行分子对接,结果见表2。由表2可知,所有化合物的结合能均低于0 kcal/mol,表明它们与受体具有较强的亲和力。在相互作用类型上,辛酸乙酯和糠醛能够与受体形成氢键;除糠醛外,其余6种配体均表现出疏水作用力;此外,苯甲醇还可与受体形成盐桥。辛酸乙酯与TAS2R14的具体对接构象见附录附图1。综合分析,这7种化合物均可被确认是酒精饮料中的挥发性苦味成分。

表2 酒精饮料中主要挥发性苦味物质与TAS2R14对接结合能及相互作用力分析结果

Tab.2 Binding energy and interaction force analysis results of of major volatile bitter compounds in alcoholic beverages with TAS2R14

苦味物质结合域结合能/(kJ/mol)相互作用力辛酸乙酯B链-15.221氢键、疏水作用力棕榈酸乙酯R链-14.096疏水作用力苯甲醇R链-20.740疏水作用力、盐桥异戊醇R链-15.426疏水作用力辛酸R链-17.016疏水作用力糠醛B链-17.313氢键苯甲醛R链-21.485疏水作用力

2.3 GSG对挥发性苦味物质苦味感知的影响

根据筛选出的挥发性苦味物质,采用外标法对酒精饮料中挥发性苦味物质的含量进行了分析,结果见表3。根据酒精饮料中含量的分析结果,以标准品分别配制了7种苦味化合物的水溶液以及混合物水溶液作为对照,并在各个溶液中添加50 mg/L的GSG,然后组织经过训练的评价员开展感官评定。

表3 7种挥发性苦味物质的标准曲线和酒精饮料中的含量

Tab.3 Standard curves of 7 volatile bitter compounds and their contents in alcoholic beverages

序号苦味物质标准曲线∗R2w(酒精饮料)/(mg/kg)1辛酸乙酯y=2.8303×107x-3.7633×1060.9982.99532棕榈酸乙酯y=2.6955×107x-8.0000×1040.9870.85993苯甲醇y=5.5224×108x-1.4000×1050.9820.03224异戊醇y=3.2722×107x-6.9860×1060.9810.65695辛酸y=2.0136×107x+9.3730×1060.9050.66956糠醛y=3.2693×107x+2.2180×1040.9980.10237苯甲醛y=2.4034×107x+9.5274×1040.9960.1124

*标准曲线方程中,y表示峰面积,x表示化合物的质量比(mg/kg)。

酒精饮料挥发性苦味物质的感观评价结果见图2。 由图2可知,不同样品在水溶液中的苦味强度存在显著差异(P<0.05)。在未引入GSG的情况下,各样品的苦味强度分布较为分散,整体变异幅度较大。其中,由多种苦味物质构成的混合样品表现出最强的苦味感知,其数值显著高于任一单一化合物样品。这一现象表明,不同苦味成分在体系中可能并非简单叠加,而是存在相互作用,进而导致苦味感受的增强,体现出潜在的协同效应。当体系中添加GSG后,所有样品的苦味强度均明显下降,且差异均达到统计学显著水平(P<0.05),充分说明GSG对多种苦味物质具有普遍而稳定的抑制作用。然而,不同苦味物质对GSG的响应程度并不一致。值得注意的是,在所有被鉴定的挥发性苦味物质中,GSG对酯类化合物(辛酸乙酯和棕榈酸乙酯等)的抑制效果明显强于醇类、酸类和醛类。这种差异性抑制现象可能与酯类化合物的理化性质及其在酒精饮料体系中的挥发行为特征密切相关。相较于醇类、酸类和醛类,酯类挥发性化合物通常具有更高的疏水性和较低的极性,在乙醇-水体系中更容易受到基质组成的影响,并参与疏水缔合或其他非共价相互作用。与此同时,GSG分子中的糖基化结构不仅增加了其分子体积和空间位阻,还提供了丰富的羟基作用位点,使其可能通过疏水相互作用及氢键作用共同影响酯类化合物在体系中的挥发行为,从而降低其在顶空中的有效释放量。

不同字母代表组间数据有显著性差异(P<0.05)。

图2 酒精饮料挥发性苦味物质的感观评价结果
Fig.2 Sensory evaluation results of volatile bitter compounds in alcoholic beverages

综合来看,GSG不仅能够显著降低体系整体的苦味水平,还可在一定程度上减弱不同苦味物质之间的感官差异,使各样品的苦味感知趋于均衡和一致。这一结果表明,GSG可能通过影响酒精饮料中挥发性苦味相关成分的释放行为或挥发特性,从而削弱其在口腔中的苦味刺激。然而,其具体的分子作用机制仍有待进一步阐明,后续结合MD的方法,对GSG的抑苦机理进行更深入和系统的验证。

2.4 GSG对挥发性苦味物质抑制的分子动力学分析结果

辛酸乙酯既属于苦味活性化合物,又具有OAV>1的特性,被选为酒精饮料的代表性苦味物质(配体)进行MD分析,同时GSG组成中含量最高的rebaudioside A(≥70%)作为另一种代表性配体,系统评估了这两种不同配体与TAS2R14苦味受体相互作用的影响。TAS2R14受体蛋白分别与辛酸乙酯、rebaudioside A进行分子动力学模拟,计算结果见图3。在MD分析中,均方根偏差(root mean square deviation, RMSD)常用于评估蛋白-配体复合物在模拟过程中的整体稳定性,其数值越小,说明体系构象变化越有限,稳定性越高[28]。由图3(a)可知,两种不同配体与TAS2R14苦味受体复合物的RMSD曲线在整个模拟过程中均保持平稳,未出现明显波动,表明辛酸乙酯和rebaudioside A均可与TAS2R14形成相对稳定的结合。相比之下,rebaudioside A体系的RMSD变化幅度略小于辛酸乙酯体系,表明rebaudioside A与苦味受体形成的复合物具有更优的结构稳定性。此外,均方根波动(root mean square fluctuation, RMSF)可反映分子动力学模拟过程中蛋白质各氨基酸残基的柔性特征,RMSF值越大,残基运动幅度越明显[29]。由图3(b)可知,TAS2R14在两种配体存在条件下的RMSF值整体均低于1 nm,且未出现显著峰值,说明辛酸乙酯和rebaudioside A的结合并未对受体氨基酸残基的局部稳定性产生明显扰动。回转半径(radius of gyration, Rg)可用于衡量蛋白-配体复合物结构的紧密程度及其在模拟过程中的稳定状态。一般而言,Rg值增大意味着体系发生膨胀,而较小且稳定的Rg值则表明结构保持致密[30]。由图3(c)可知,2组复合物的Rg值均集中在2.0～2.1 nm,且随时间变化平缓,进一步证明辛酸乙酯和rebaudioside A均能与TAS2R14形成稳定构象。其中,rebaudioside A体系的Rg波动幅度相对更小,表明其复合物结构更为紧凑和稳定。为进一步探讨配体与受体结合位点的相互作用特征,计算了在模拟过程中起主要稳定作用的氢键数量。由图3(d)可知,TAS2R14分别与辛酸乙酯和rebaudioside A之间的氢键数目在整个模拟阶段内基本维持在2～4个和1～2个,曲线变化平稳,说明两种配体均可与受体形成稳定的氢键网络。其中,rebaudioside A与TAS2R14之间形成的氢键数量相对更多,进一步表明其结合能力和复合物稳定性优于辛酸乙酯[31]。从RMSD、RMSF及Rg等参数变化趋势来看,体系在模拟过程中未出现明显结构漂移,整体趋于稳定,表明在该时间尺度内已达到相对平衡状态。

图3 TAS2R14受体蛋白与辛酸乙酯、rebaudioside A的分子动力学模拟结果
Fig.3 Molecular dynamics simulation results of TAS2R14 receptor protein with ethyl caprylate and rebaudioside A

在复合体系达到稳定状态后,采用分子力学/泊松-玻尔兹曼表面积 (molecular mechanics/poisson-boltzmann surface area, MM/PBSA) 方法 [32]对TAS2R14蛋白分别与辛酸乙酯和rebaudioside A的平均结合自由能进行了评估,结果见图4。由图4可知,TAS2R14蛋白与rebaudioside A以及辛酸乙酯的平均结合自由能分别为-28.88 kJ/mol和-18.96 kJ/mol。 结果表明,与辛酸乙酯相比,TAS2R14蛋白对rebaudioside A表现出更强的结合亲和力。

VDWAALS、EEL、EGB、ESURF、GGAS、GSOLV、TOTAL分别代表范德华力、静电能、极性溶剂化能、非极性溶剂化能、分子力学项、溶剂化能项和平均结合自由能。

图4 TAS2R14受体蛋白与rebaudioside A和辛酸乙酯的平均结合自由能
Fig.4 Average binding free energies of TAS2R14 receptor protein with rebaudioside A and ethyl caprylate

由图3和图4可知,rebaudioside A能够更有效地占据苦味受体TAS2R14的位点,从而抑制辛酸乙酯和TAS2R14的结合,从侧面验证了感官评价的结果,解释了GSG对酒精饮料的苦味抑制源于对酒精饮料中挥发性苦味物质的抑制作用。从受体作用层面来看,分子对接和MD结果表明,酯类苦味物质辛酸乙酯与TAS2R14受体的结合主要依赖疏水相互作用,而rebaudioside A与受体之间则表现出更强的结合亲和力和更稳定的氢键网络。这种结合优势使GSG更容易在受体结合位点上形成“优先占位”,从而对以疏水作用为主的酯类苦味配体产生更显著的竞争性阻断效应。上述结果从挥发行为调控和受体水平竞争两方面,为GSG对酯类挥发性苦味物质表现出更强抑制效果提供了合理解释。本研究采用100 ns分子动力学模拟对蛋白-配体复合体系的稳定性进行评估。然而,考虑到蛋白质构象变化可能存在更长时间尺度的动态调整过程,仍不能完全排除长时间模拟下出现构象重排的可能性。未来可通过延长模拟时间或开展多次独立重复模拟,以进一步验证结果的稳健性与可靠性。

3 结 论

通过对挥发性成分分析、感官评价以及MD的综合研究,系统分析了GSG对自制酒精饮料中挥发性苦味的抑制作用及其作用机理。结果表明,GSG的添加显著降低了酒精饮料中多类挥发性化合物的总体含量及其香气活力值,其中辛酸乙酯、棕榈酸乙酯、苯甲醇、异戊醇、辛酸、糠醛和苯甲醛被确认为具有明确苦味贡献的挥发性物质。感官评价结果与化学分析结果高度一致,表明GSG能够有效削弱上述挥发性苦味物质所引起的苦味感知,且对酯类苦味物质的抑制作用尤为突出。MD进一步表明,GSG代表性结构单元与苦味受体之间可形成稳定复合物,其结合稳定性和结合自由能均优于典型挥发性苦味配体,从而在受体层面竞争性阻断苦味信号的产生。这一结果表明,GSG对酒精饮料苦味的抑制并非仅来源于对非挥发性苦味成分的影响,而是通过降低挥发性苦味物质释放并干预其与苦味受体相互作用的双重途径协同实现,与既有研究中关于其改善风味品质的结论形成了有益补充,同时也阐明了GSG对酯类苦味物质的抑制更显著的机制。

需要说明的是,本研究仅基于自建酒精饮料模型体系开展,尚未在市售啤酒、白酒及果酒等不同类别产品中进行验证。鉴于各类酒精饮料在乙醇含量、基酒构成及风味基质复杂度方面差异明显,仍需在多种商业化体系中开展对照实验,以系统评估GSG抑制苦味的适用范围及实际应用价值。在分子动力学分析中,选取rebaudioside A作为代表性分子,从受体层面探讨其作用机制。然而,不同糖基化程度及糖苷键连接方式的差异可能改变分子空间构象及其与苦味受体的结合模式;此外,低丰度组分亦可能通过协同效应影响整体抑苦表现。因此,未来有必要对GSG的组成进行精细化表征,并对单体成分开展分离与功能评价,以明确各组分的相对贡献。人类苦味感知通常涉及多个TAS2R受体的协同参与。本研究主要关注苦味物质与广谱识别受体TAS2R14之间的相互作用,而不同苦味配体可能同时激活多种受体,并在受体层面产生叠加或协同效应,最终形成整体苦味信号。后续研究应结合多受体分子对接与动力学模拟方法,系统阐明不同酒精饮料体系中挥发性苦味成分在多受体层面的协同激活机制及其调控路径,从而为酒精饮料风味的精准调控提供更为可靠的理论支撑。

附录:补充数据

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Appendix:supplementary data

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Inhibition Mechanism of Glucosylated Steviol Glycosides on Volatile Bitter Substances in Alcoholic Beverages

YAO Jiawei1, YAO Lingyun1, ZHU Liping2, WANG Huatian1, SONG Shiqing1,YU Chuang1, SUN Min1,*, FENG Tao1,*

(1. Faculty of Flavour Fragrance and Cosmetics, Shanghai Institute of Technology, Shanghai 201418, China;2. Zhucheng Haotian Pharm Co., Ltd., Zhucheng 224200, China)

Abstract： To elucidate the effect of glucosylated steviol glycosides (GSG) on volatile-associated bitterness in alcoholic beverages and its molecular mechanisms, a formulated alcoholic beverage model system was employed to investigate the influence of GSG on the volatilization behavior, sensory perception, and receptor binding of volatile bitter compounds. Headspace solid-phase microextraction gas chromatography-olfactometry-mass spectrometer was used to determine the odor activity values of volatile compounds, to identify key aroma-active constituents, and to evaluate the impact of GSG addition on volatile release in alcoholic beverages. Molecular docking combined with sensory evaluation was applied to identify volatile bitter compounds in alcoholic beverages and to characterize their binding interactions with the human bitter taste receptor TAS2R14. Furthermore, sensory analysis was conducted to verify the inhibitory effect of GSG on the bitterness elicited by volatile compounds. Molecular dynamics simulations were performed using the TAS2R14 receptor protein in complex with the identified major volatile bitter compounds and the principal component of GSG, rebaudioside A, to elucidate the inhibitory mechanism of GSG at the receptor level. The result showed that 40 volatile compounds were detected in the model alcoholic beverage. The headspace concentrations of all compounds, except lauric acid, were significantly reduced following GSG addition. Based on GC-O analysis and calculated binding energies with TAS2R14, 7 volatile compounds were identified as the primary volatile contributors to bitterness in alcoholic beverages, including ethyl caprylate, ethyl palmitate, benzyl alcohol, isoamyl alcohol, octanoic acid, furfural, and benzaldehyde. Sensory evaluation demonstrated that GSG significantly reduced the perceived bitterness intensity of these 7 compounds, and a more pronounced inhibitory effect was observed for bitter esters. Molecular simulation results revealed that rebaudioside A could form a stable complex with TAS2R14 and competitively inhibit the binding of bitter compounds to the receptor through a more favorable binding free energy profile and increased hydrogen-bond interactions. These findings indicated that GSG suppressed bitterness in alcoholic beverages by reducing the release of volatile bitter compounds and by competitively blocking their binding to bitter taste receptors. This study provided a theoretical basis for the optimization of flavor quality in alcoholic beverages.

Keywords： glucosylated steviol glycosides; alcoholic beverages; volatile bitter compounds; bitter taste receptors; molecular dynamics simulation

doi：10.12301/spxb202600037

文章编号：2095-6002(2026)02-0082-11

引用格式：姚佳炜,姚凌云,朱理平,等. 葡萄糖基甜菊糖苷对酒精饮料挥发性苦味物质的抑制机制[J]. 食品科学技术学报,2026,44(2):82-92. YAO Jiawei,YAO Lingyun,ZHU Liping,et al. Inhibition mechanism of glucosylated steviol glycosides on volatile bitter Substances in alcoholic beverages[J]. Journal of Food Science and Technology, 2026,44(2):82-92.

中图分类号： TS262.8

文献标志码： A

收稿日期： 2026-01-23

基金项目： 上海应用技术大学校企联合项目(27220H240337-A06);国家自然科学基金资助项目(32402281)。

Foundation： Shanghai Institute of Technology of Applied Sciences Joint University-Enterprise Program (27220H240337-A06); National Natural Science Foundation of China (32402281).

第一作者： 姚佳炜,男,硕士研究生,研究方向为食品风味分析。

*通信作者： 孙 敏,女,副教授,博士,主要从事食品风味化学方面的研究;冯 涛,男,教授,博士,主要从事食品风味化学方面的研究。

(责任编辑：李 宁)