杂柑是通过多种柑橘品种杂交得到的水果,大多为橘类和橙类的杂交后代。兼有橙、橘的营养、风味和果实易剥皮等特性,可鲜食可加工,被视为21世纪柑橘主要推广品种[1]。其中在中国栽培面积比较大,广受欢迎的有沃柑、春见、爱媛38号等品种。沃柑(Citrus reticulate Blanco‘Orah’)是“坦普尔”橘橙和“丹西”红橘的杂交品种,属于高糖晚熟的杂柑品种,其挂果时间长,能很好地改善柑橘的产业结构,具有极高的生产价值;春见(Citrus reticulate Chun Jian)是由“清见”与椪柑杂交选育成的晚熟杂柑类品种,易剥皮、化渣、酸甜适口;爱媛38号(Citrus reticulata ‘Ai Yuan 38’)是由“南香”柑橘与“西子香”杂交而成的早熟橘橙类杂柑,入口化渣、汁多、气味香甜[2]。由于沃柑、春见、爱媛38号3个品种成熟时间不同,能很好地契合市场需求,延长上市时间,且广受消费者喜爱,为当前市场杂柑主要品种,本研究选用沃柑、春见、爱媛38号3个杂柑品种作为研究对象。

香气是评价柑橘类水果品质最重要的因素之一[3]。研究表明,柑橘类水果中有300多种香气化合物,主要包括萜类、酯类、醇类、酮类、酸类和醛类[4-5]。而萜类化合物是柑橘类水果中最重要的香气物质,主要包括单萜、倍半萜和二者衍生物[6-7]。萜类香气化合物在柑橘类水果中发挥着至关重要的作用。就杂柑中萜类化合物而言,有研究报道,萜类物质不仅影响柑橘的香气,还能对果实起到抗病虫害的作用[8]。Umano等[9]对“不知火”杂柑果肉中挥发性物质进行分析,共检测出54种挥发性物质,其中萜类化合物26种,对整体香气具有重要影响。Miyazaki等[10]研究发现柑橘类水果杂交品种的遗传背景能够影响其挥发性物质的成分及含量,拥有橘类遗传背景的杂交品种中挥发性物质的种类和含量会相对较少,但醛类挥发性化合物较多;而拥有甜橙类遗传背景的杂交品种会拥有更多的倍半萜和酯类香气化合物。Pan等[11]发现D-柠檬烯在柑橘类水果中能够作为其他香气化合物的“香气增强剂”。由于杂柑品种多样,目前对于杂柑中香气物质的研究并不全面。杂柑中香气物质种类众多,对于杂柑中香气物质的转化机制也报道较少。而挥发性萜类化合物是杂柑类水果中重要的香气物质,因此本研究拟对沃柑、春见、爱媛38号3种杂柑果肉中挥发性萜类化合物的转化机制进行研究。

植物中萜类化合物的生成途径主要有甲基赤藓醇磷酸酯(methylerythritol phosphate,MEP)途径和甲羟戊酸(mevalonic acid,MVA)途径[12]。这2条途径都可分为3个阶段,第1阶段为关键中间体异戊烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate,IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl pyrophosphate, DMAPP)的合成;第2阶段为牻牛儿基焦磷酸(geranylpyrophosphate,GPP)、法尼基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate,FPP)2个前体物质的合成,这2个阶段已经研究得很清楚。而第3阶段决定了萜类化合物的多样性,由第3阶段生成的萜类化合物在酶或酸的催化作用下又可以在植物体内相互转化。因此,本研究对沃柑、春见、爱媛38号3种杂柑果肉中所含的萜类化合物的种类及含量进行检测分析,并模拟杂柑果肉中的酶环境和酸性环境,用所检测出的萜类化合物的标准物质探究萜类化合物在杂柑果肉中的转化机制。希望研究可为杂柑类水果加工制品的增香、保香及品质优化提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

沃柑,2023年12月31日采摘自广西壮族自治区南宁市武鸣区甘圩镇赖坡村(23° 15′N, 108° 23′E);爱媛38号和春见,分别于2024年1月1日和2024年2月26日采摘自湖北省宜昌市夷陵区小溪塔街道王家冲果园(30° 47′N, 111° 24′E)。每种杂柑样品均从3棵同品种果树上采摘成熟无物理损伤和病害的果实5 kg。

氯化钠、硫酸铵、蔗糖、葡萄糖、柠檬酸、磷酸氢二钠、抗坏血酸为分析纯,果糖、L-丝氨酸、L-天冬氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸为生物纯,国药集团化学试剂有限公司。

C7～C30正构烷烃、环己酮(98%)、D-柠檬烯(99%)、γ-松油烯(97%)、芳樟醇(97%)、玫瑰醚(99%)、4-萜品醇(95%)、α-松油醇(96%)、二氢香芹酮(98%)、橙花醇(97%)、香芹醇(97%)、香茅醇(95%)、L-香芹酮(98%)、紫苏醛(92%),美国Sigma-Aldrich公司。实验用水均采用双蒸水。

1.2 仪器与设备

HR1922型榨汁机,飞利浦(中国)投资有限公司;WYT-4型数字手持式折射计,北京扬特科技仪器有限公司;PHSJ-4A型pH计,上海雷磁仪电科学仪器股份有限公司;CR21G型冷冻离心机,日本日立有限公司;CONCEPT型多功能样品固相微萃取前处理系统,德国PAS公司;BSA224S型电子天平,德国赛多利斯公司;6890N/5975型MSD气相色谱-质谱联用仪[配置DB-5MS型色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)],美国安捷伦公司;DVB/CAR/PDMS 固相微萃取头(50/30 μm,1 cm),美国Supelco公司;MDF-U50V型-80 ℃超低温冰箱,日本SANYO 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理

将采摘后的杂柑用保温箱快速运至实验室,手工剥皮;剥皮过程尽量避免果皮中挥发油污染果肉。将剥皮后的果肉分成小果瓣,将5 kg果实的小果瓣混匀。每种杂柑样品各分装200 g果肉用作果肉中挥发性化合物检测,分装1 kg果肉用作果汁理化指标的测定和果肉中粗酶的提取;分装后贮藏于-80 ℃超低温冰箱中备用。

1.3.2 果汁理化指标的测定

从超低温冰箱中取出分装的1 kg果肉于4 ℃条件下解冻,趁冷榨汁,将果汁置于250 mL离心管中,用冷冻离心机在10 000 r/min的转速下离心30 min,取上清液。上清液用于果汁理化指标的测定和粗酶的提取。

用量筒准确测量上清液的体积并计算杂柑的出汁率;用手持式折射计测定果汁中可溶性固形物含量;用pH计测定果汁pH值。可溶性固形物含量和pH值均重复测定3次,取平均值。

1.3.3 果肉中挥发性萜类化合物的定性和定量检测方法

挥发性物质萃取及检测采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用(head space-solid phase microextraction- gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)方法。萃取及GC-MS检测条件参考课题组前期优化的水果挥发性化合物的萃取及GC-MS检测条件[13]。参照文献[14]的方法进行定性和定量分析。

从超低温冰箱中取出分装的200 g果肉于4 ℃条件下解冻,趁冷榨汁,将果汁置于100 mL离心管中,用冷冻离心机在10 000 r/min的转速下离心30 min,取上清液[15]。取4份5 mL上清液于20 mL顶空瓶中,各加入1.5 g NaCl和磁力搅拌子,并加入15.0 μL 环己酮内标(1.354 3 mg/mL 乙醇溶液),1份用于挥发性物质定性分析,3份用于挥发性物质定量分析。

1.3.4 杂柑果肉中粗酶的提取

参考文献[16]的方法并进行优化,用于提取杂柑果肉中的粗酶。

取1.3.2节制备的500 mL上清液置于1 L烧杯中。磁力搅拌下,依次加入固体硫酸铵,至硫酸铵的质量分数分别为30%、50%、70%、90%。

每个质量分数下,待硫酸铵完全溶解后于4 ℃条件下下静置30 min,待沉淀析出,用冷冻离心机在10 000 r/min的转速下离心15 min,收集沉淀。并在上清液中再次加硫酸铵溶解至下个质量分数,将每次所得沉淀收集合并。

配制0.2 mol/L磷酸氢二钠-0.1 mol/L柠檬酸缓冲液(McIlvaine buffer solution,MBS),调至与原果汁相同的pH值。

向沉淀中加入适量MBS至完全溶解,以相同浓度的MBS作为透析液,将溶解后的沉淀分装于3 kDa的透析袋中透析48 h,每4 h更换一次透析液[17],以去除粗酶中残留的挥发性物质等小分子物质。透析结束后用0.2 mol/L磷酸氢二钠或0.1 mol/L 柠檬酸调节透析袋中溶液的pH值与原果汁相同,并用缓冲溶液稀释至250 mL,即为粗酶溶液。

1.3.5 萜类化合物的转化实验设计

根据1.3.3节挥发性萜类化合物的定性分析结果,使用检测出的萜类化合物的标准物质模拟杂柑果肉中萜类化合物在酸和酶的环境下的转化反应。

取50 μL萜类化合物标准品加入5 mL容量瓶中用无水乙醇定容,制成体积分数为1%的稀释标准品。萜类化合物的转化实验设计见表1。

表1中所有样品均放置于38 ℃培养箱中避光反应14 d,每隔24 h振摇1次。反应结束后放入4 ℃冰箱冷却终止反应。每次反应均做4次平行实验,1份用于定性分析,3份用于定量分析。

1.3.6 萜类化合物转化结果的定性和定量检测

向1.3.5节中用于定性分析的样品中加入1.5 g NaCl和磁力搅拌子,并加入15.0 μL环己酮溶液(1.354 3 mg/mL乙醇溶液)作为内标,进行定性检测。

采用内标法和外标法相结合的方法进行定量分析。内标法为用环己酮(1.354 3 mg/mL 乙醇溶液)作为内标化合物,采用选择离子扫描(SIM)模式测定样品中待测组分与环己酮峰面积的比率。外标法为用0.2 mol/L磷酸氢二钠-0.1 mol/L柠檬酸缓冲液,调其pH值至7.0,将标准物质溶入缓冲溶液中配制相应浓度梯度,并加入内标环己酮进行测定,得到标准物质浓度-峰面积比率标准曲线方程,计算待测物质的含量。

1.3.7 萜类化合物的转化反应判定

为判定萜类化合物的酸催化转化反应程度,表1中M组某萜类化合物反应后的产物含量与W组中相同产物含量之比得到产率比,若W组中未检测出对应产物,则按0.1 μg/L计;若某萜类化合物在M组中相较于W组中反应生成的产物的产率比达到2倍以上,则说明该反应由酸催化;产率比越大,转化反应越容易发生。

为判定萜类化合物的酶催化转化反应程度,表1中O、H、E组某萜类化合物反应后产物含量与M组中相同产物含量之比得到产率比,若M组中未检测出对应产物,则按0.1 μg/L计;若同一萜类化合物在O、H、E组中相较于M组中的产率比达到2倍以上,则说明该反应由酶催化,产率比越大转化反应越容易发生。若表1中对照组中残留的游离和键合态萜类化合物有检出,则在O、H、E组中去除该萜类化合物的含量。

1.4 数据处理

用IBM SPSS Statistics 26进行单因素方差分析(ANOVA),Duncan多重检验,当P<0.05时,差异被认为具有统计学意义。

萜类化合物含量数据为3次实验的平均值±标准偏差,平均值保留2位小数,标准偏差小数点后保留2位有效数字。酸催化反应产率比和酶催化反应产率比用热图表示,热图用Graphpad Prism 10.1.2软件绘制。由于反应产率比数值跨度较大,为能清晰展现数值,将产率比小于50的数值随着数值的增大颜色由浅到深表示。当产率比大于50时,发生了显著反应,用同一种颜色突出表示。转化路径图用Chemdraw软件绘制。

2 结果与分析

2.1 杂柑出汁率、可溶性固形物含量和pH值分析

对沃柑、春见、爱媛38号3种杂柑的出汁率、可溶性固形物含量和pH值的分析结果见表2。

由表2可知,3种杂柑果肉中,春见的出汁率最低,爱媛38号的出汁率最高,可溶性固形物含量也最高。沃柑的pH值最高,春见的pH值最低。通过显著性分析发现,pH值在3个品种间表现出显著差异(P<0.05),爱媛38号的可溶性固形物含量与沃柑和春见间也有显著性差异(P<0.05)。

2.2 杂柑中萜类化合物的种类及含量分析

从3种杂柑中共检测出16种萜类化合物。其中沃柑有4种萜类化合物、春见有5种萜类化合物、爱媛38号有15种萜类化合物。各挥发性萜类化合物定量所选的特征离子、标准物质以及标准曲线方程及含量如表3所示。

由表3可知,共检测出16种萜类化合物,均为单萜化合物,其中萜烯类有3种(D-柠檬烯、γ-松油烯、p-1,3,8-薄荷三烯),萜醇类有7种(芳樟醇、p-2,8-薄荷二烯醇、4-萜品醇、α-松油醇、香芹醇、橙花醇、香茅醇),萜酮类有4种(6-莰烯酮、二氢香芹酮、L-香芹酮、异薄荷二烯酮),其他含氧萜类有2种(玫瑰醚、紫苏醛)。D-柠檬烯和α-松油醇在3种杂柑中均存在,而紫苏醛仅在春见中被检测出。其中D-柠檬烯在3种杂柑中含量均最高,在爱媛38号中达1 180.23 μg/L,这与Hu等[18]的研究结果相似。D-柠檬烯作为一种次生代谢产物在柑橘类水果中广泛存在,因其具有广谱抑菌性对柑橘类水果的生长和贮存具有重要意义[19]。虽其含量很高,但是否为柑橘类水果中的关键香气化合物还存在一定的争议,有研究表明,当1g 果肉中的D-柠檬烯含量超过1.90×10-4 g时,对香气有重要贡献[20]。爱媛38号果肉中萜类化合物种类最多,共15种,其中9种仅在爱媛38号杂柑中出现。在爱媛38号杂柑中,萜醇类在所有检出的萜类化合物中种类最多,其中芳樟醇含量在萜醇类中最高,为20.40 μg/L。研究表明,芳樟醇为杂柑提供了典型的花香,并产生令人愉快的气味[21]。

2.3 萜类化合物的转化机制分析

根据2.2节杂柑中挥发性萜类化合物的定性分析结果,使用检测出的D-柠檬烯、γ-松油烯、芳樟醇、玫瑰醚、4-萜品醇、α-松油醇、二氢香芹酮、橙花醇、香芹醇、香茅醇、L-香芹酮、紫苏醛等12种萜类化合物的标准物质模拟杂柑果肉中萜类化合物在酸和酶的环境下进行转化反应。

植物体中的单萜化合物主要通过MEP途径生成牻牛儿基焦磷酸(geranylpyrophosphate,GPP)前体物质,进而通过生物合成途径生成各种萜类化合物。然而,萜类化合物除直接通过萜类前体转化生成外,也存在着萜类化合物之间的相互转化。测定杂柑转化反应中挥发性萜类化合物的定量离子、定量标准及标准曲线方程如表4所示。萜类标准品在纯水、pH=3.87的MBS和杂柑粗酶溶液中的转化反应结果如表5所示。

2.3.1 酸催化反应结果

根据表5结果,计算M组与W组反应产物产率比,见图1。其中产率比大于2时表示由酸催化发生了转化反应,产率比大于50时表示发生了显著反应。据各实验组中反应物与产物的结构特点,提出了萜类化合物在酸催化作用下相互之间的转化途径,如图2所示。

由图1可知,在酸性条件下,D-柠檬烯可以转化为紫苏醛和二氢香芹酮,D-柠檬烯的环内双键在水和氢离子的作用下转变为羟基,最后氧化成羰基转化为二氢香芹酮。D-柠檬烯可以被氧化生成紫苏醇,进一步氧化生成紫苏醛[22],如图2(a)所示。芳樟醇与橙花醇结构十分相似,可以在酸性条件下相互转化,这与Hausch等[23]的报道结果相一致。芳樟醇的羟基在氢离子的作用下离去一分子水,生成碳正离子中间体,后经分子内质子转移、异构化以及水合作用,最终转化为橙花醇。在这一过程中,碳正离子中间体还可以进攻非共轭双键实现环化,再经过水合作用或离去氢离子转化成α-松油醇,如图2(b)所示。这与Conde-Martínez等[24]的报道结果一致。4-萜品醇的羟基在氢离子的作用下失去一分子水,生成碳正离子中间体,再经离去氢离子最终转化为γ-松油烯,如图2(c)所示。二氢香芹酮的羰基在氢离子的作用下被还原为羟基,后经分子内质子转移和水合作用转化为二羟基化合物。二羟基化合物再经过消去反应与氧化反应生成L-香芹酮,如图2(d)所示。橙花醇的羟基在氢离子的作用下离去一分子水生成碳正离子中间体,经分子内质子转移、异构化和水合作用,最终转化为芳樟醇。在这一过程中,端基碳正离子中间体还可以进攻非共轭双键实现环化,再经过水合作用转化成α-松油醇或4-萜品醇,如图2(e)所示。这与Bi等[21]的研究结果相似,这两种化合物在柑橘果汁中通常被认为是一种不新鲜的味道。香茅醇可以转化为芳樟醇和α-松油醇。香茅醇的羟基在氢离子的作用下离去一分子水生成碳正离子中间体,然后脱质子再氧化而形成芳樟醇,通过与图2(b)的类似过程再转化为α-松油醇,如图2(f)所示。

2.3.2 酶催化反应结果

在O、H、E组的对照组中均未检测出萜类化合物。根据表5结果计算O、H、E组与M组的产物产率比如图3所示。其中产率比大于2时表示由酶催化发生了转化反应,产率比大于50时表示发生了显著反应。根据各实验组中反应物与产物的结构特点,提出了萜类化合物在酶催化作用下相互之间的转化途径,如图4所示。

由图3(a)可知,在沃柑的酶催化反应中,以 4-萜品醇为反应物,产物中检测到了大量芳樟醇,这可能是4-萜品醇在酶的作用下,氢离子与4-萜品醇的羟基结合并失去一分子水,生成了环状碳正离子中间体,随后在酶的作用下,六元环结构被打开,碳正离子与环内双键形成烯丙基共轭结构,最后经过分子内质子转移以及水合作用,最终生成芳樟醇[25],如图4(e)所示。以α-松油醇为反应物,产物中检测到了较高浓度的D-柠檬烯与芳樟醇。α-松油醇与4-萜品醇的结构较为相似,可通过碳正离子的转移与4-萜品醇相似的路径转化成芳樟醇。另外,α-松油醇的羟基在酶的催化作用下,可以与相邻碳原子上的氢原子以一分子水的形式离去,生成D-柠檬烯,如图4(f)所示。

由图3(b)可知,在春见的酶催化反应中,D-柠檬烯与γ-松油烯可以高效相互转化。D-柠檬烯的环外双键在酶与氢离子的作用下,生成环外碳正离子中间体,再通过分子内质子转移,碳正离子转移至环内,最后经氢离子的离去生成γ-松油烯[25],如图4(a)所示。γ-松油烯转化为D-柠檬烯的过程为上述路径的逆过程,如图4(b)所示。α-松油醇和紫苏醛均可以转化为D-柠檬烯,紫苏醛还可以高效转化为γ-松油烯和α-松油醇,产率比分别达到367.8和811.9。紫苏醛环外叔碳原子上的氢原子,在酶的作用下离去,生成碳正离子中间体,经过水合作用生成相应的醇,醛基通过酶的催化被还原失去,最终生成α-松油醇,如图4(l)所示。

由图3(c)可知,在爱媛38号的酶催化反应中,D-柠檬烯可以转化为香芹醇,这可以通过氧化酶的作用实现[22,26],如图4(a)所示。γ-松油烯可以转化为L-香芹酮、香芹醇和D-柠檬烯,γ-松油烯转化为D-柠檬烯的过程与春见的路径类似,D-柠檬烯再经过两次不同程度的氧化作用,分别转化成香芹醇和L-香芹酮,如图4(b)所示。芳樟醇可以转化为香芹醇和γ-松油烯,芳樟醇的羟基在酶与氢离子的作用下以水分子的形式离去,生成烯丙基共轭碳正离子中间体,经过异构化和环化,生成环状碳正离子中间体。环状碳正离子中间体一方面可以通过离去氢离子生成γ-松油烯,另一方面可以通过生成D-柠檬烯途径,再氧化生成香芹醇,如图4(c)所示。玫瑰醚可以转化为香芹醇和α-松油醇,玫瑰醚的环氧六元环结构可以开环生成二羟基结构,接着羟基进攻碳碳双键环化生成碳正离子中间体,碳正离子中间体通过分子内质子转移离去氢离子最终生成α-松油醇[27]。α-松油醇的羟基在酶的作用脱去水分子生成D-柠檬烯,再经氧化可以转化成香芹醇。4-萜品醇可以转化为香芹醇、α-松油醇、γ-松油烯和D-柠檬烯,转化路径与前述类似[25],如图4(e)所示。α-松油醇可以转化为香芹醇、芳樟醇和D-柠檬烯,和春见所述路径相同,如图4(f)所示。二氢香芹酮可以转化为4-萜品醇和芳樟醇,二氢香芹酮在酶的作用下还原成相应的醇,再与氢离子结合生成环状碳正离子中间体。一方面,环状碳正离子中间体经过进一步还原成烯烃以及水合作用,可以转化成4-萜品醇[25]。另一方面,环状碳正离子中间体通过还原反应和开环反应生成烯丙基共轭结构,最后经水合作用生成芳樟醇,如图4(g)所示。香芹醇可以转化为L-香芹酮、二氢香芹酮和D-柠檬烯,香芹醇的羰基与共轭双键,在氧化酶和还原酶的作用下,可以实现四种物质间的相互转化,如图4(h)所示。橙花醇可以转化为α-松油醇和γ-松油烯,橙花醇的羟基在酶和氢离子的作用下以水分子的形式离去生成烯丙基碳正离子中间体,碳正离子进攻非共轭双键实现分子环化,最后通过离去不同位置的氢离子,最终转化成α-松油醇和γ-松油烯[28-29],如图4(i)所示。香茅醇可以通过环化和水合作用转化为4-萜品醇,如图4(j)所示。L-香芹酮可以转化为香芹醇、二氢香芹酮和芳樟醇,L-香芹酮在还原酶的作用下,可以被不同程度地还原成香芹醇和二氢香芹酮[30-32],二氢香芹酮可以通过前述路径转化成芳樟醇,如图4(k)所示。

3 结 论

本研究结果表明,在沃柑、春见和爱媛38号3种杂柑果肉中,共检测出16种挥发性萜类化合物,其中D-柠檬烯和α-松油醇在3种杂柑中均被检测出,且D-柠檬烯含量最高。通过对检测出的挥发性萜类化合物的酸催化和酶催化转化过程进行研究发现,在酸性环境下,10种萜类化合物间存在相互转化关系。D-柠檬烯可转化为紫苏醛,芳樟醇可转化为橙花醇,二氢香芹酮可转化为L-香芹酮,橙花醇可转化为4-萜品醇和芳樟醇,香茅醇可转化为α-松油醇和芳樟醇仅在酸催化下发生。在酶的催化下,12种挥发性萜类化合物间存在着复杂的转化网络,其中4-萜品醇能转化生成5种萜类化合物,香芹醇能被7种挥发性萜类化合物转化生成。研究结果旨在判断萜类化合物转化的基本条件,为杂柑中挥发性萜类化合物的转化提供一定的理论基础,对杂柑香气品质的调控提供一定的研究方向和理论数据,进而为杂柑类水果贮藏和加工制品的保香增香提供理论依据。

参考文献：

[1] 王敏, 杨蕾, 李勋兰, 等. 6个杂柑品种与4种砧木嫁接亲和性初步评价[J]. 中国南方果树, 2022, 51(5): 14-19.
WANG M, YANG L, LI X L, et al. Evaluation of the compatibility of six hybrid Citrus varieties with four rootstocks[J]. South China Fruits, 2022, 51(5): 14-19.

[2] 陈细羽. 我国主要杂柑品种的营养功能成分评价以及产地差异研究[D]. 重庆: 西南大学, 2021.
CHEN X Y. Nutritional functional components evaluation and traceability differences of main hybrid Citrus in China[D]. Chongqing: Southwest University, 2021.

[3] 肖作兵, 蒋新一, 牛云蔚. 水果香气物质分析研究进展[J]. 食品科学技术学报, 2021, 39(2): 14-22.
XIAO Z B, JIANG X Y, NIU Y W. Research progress on analysis of aroma compounds in fruits[J]. Journal of Food Science and Technology, 2021, 39(2): 14-22.

[4] PEREZ-CACHO P R, ROUSEFF R L. Fresh squeezed orange juice odor: a review[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2008, 48(7): 681-695.

[5] ZHANG H P, XIE Y X, LIU C H, et al. Comprehensive comparative analysis of volatile compounds in Citrus fruits of different species[J]. Food Chemistry, 2017, 230: 316-326.

[6] CHOI H S. Characteristic odor components of kumquat (Fortunella japonica Swingle) peel oil[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53(5): 1642-1647.

[7] LIU C H, CHENG Y J, ZHANG H Y, et al. Volatile constituents of wild Citrus Mangshanyegan (Citrus nobilis Lauriro) peel oil[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60(10): 2617-2628.

[8] 张海朋. 不同柑橘种质挥发性物质谱分析及相关基因挖掘和验证[D]. 武汉: 华中农业大学, 2019.
ZHANG H P. Volatile profiling of various citrus germplasms in combination with mining and characterization of volatile biosynthetic genes[D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2019.

[9] UMANO K, HAGI Y, SHIBAMOTO T. Volatile chemicals identified in extracts from newly hybrid Citrus, dekopon (Shiranuhi mandarin Suppl. J.)[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002, 50(19): 5355-5359.

[10] MIYAZAKI T, PLOTTO A, BALDWIN E A, et al. Aroma characterization of tangerine hybrids by gas-chromatography-olfactometry and sensory evaluation[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2012, 92(4): 727-735.

[11] PAN X, BI S, LAO F, et al. Factors affecting aroma compounds in orange juice and their sensory perception: a review[J]. Food Research International, 2023, 169: 112835.

[12] VRANOV E, COMAN D, GRUISSEM W. Network analysis of the MVA and MEP pathways for isoprenoid synthesis[J]. Annual Review of Plant Biology, 2013, 64: 665-700.

[13] YANG Y N, ZHENG F P, YU A N, et al. Changes of the free and bound volatile compounds in Rubus corchorifolius L. f. fruit during ripening[J]. Food Chemistry, 2019, 287: 232-240.

[14] 严文怡, 谢雅婷, 马樱柯, 等. 温州蜜柑果肉不同成熟期及贮藏期挥发性物质变化[J]. 食品工业科技, 2025, 46(12): 352-359.
YAN W Y, XIE Y T, MA Y K, et al. Changes in volatile compound composition in Satsuma mandarin pulp during different ripening and storage periods[J]. Science and Technology of Food Industry, 2025, 46(12): 352-359.

[15] 谢雅婷, 严文怡, 杨艳, 等. 不同成熟度纽荷尔脐橙果肉中香气成分变化规律研究[J]. 食品科学技术学报, 2025, 43(3): 125-134.
XIE Y T, YAN W Y, YANG Y, et al. Study on mechanism of aroma components variation in pulp of newhall navel oranges at different maturities[J]. Journal of Food Science and Technology, 2025, 43(3): 125-134.

[16] 张学俊, ABELL C. 酶的硫酸铵沉淀浓度范围的确定[J]. 贵州工业大学学报(自然科学版), 2000, 29(6): 25-29.
ZHANG X J, ABELL C. The determination of saturation percentages of ammonium[J]. Journal of Guizhou University of Technology (Natural Science Edition), 2000, 29(6): 25-29.

[17] MARIACA R, BOSSET J O. Instrumental analysis of volatile (flavour) compounds in milk and dairy products[J]. Le Lait, 1997, 77(1): 13-40.

[18] HU Z H, CHEN M J, ZHU K J, et al. Multiomics integrated with sensory evaluations to identify characteristic aromas and key genes in a novel brown navel orange (Citrus sinensis)[J]. Food Chemistry, 2024, 444: 138613.

[19] ESPINA L, SOMOLINOS M, LORN S, et al. Chemical composition of commercial Citrus fruit essential oils and evaluation of their antimicrobial activity acting alone or in combined processes[J]. Food Control, 2011, 22(6): 896-902.

[20] AHMED E M, DENNISON R A, SHAW P E. Effect of selected oil and essence volatile components on flavor quality of pumpout orange juice[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1978, 26(2): 368-372.

[21] BI S, SUN S C, LAO F, et al. Gas chromatography-mass spectrometry combined with multivariate data analy-sis as a tool for differentiating between processed orange juice samples on the basis of their volatile markers[J]. Food Chemistry, 2020, 311: 125913.

[22] WRBLEWSKA A. The epoxidation of limonene over the TS-1 and Ti-SBA-15 catalysts[J]. Molecules, 2014, 19(12): 19907-19922.

[23] HAUSCH B J, LORJAROENPHON Y, CADWALLADER K R. Flavor chemistry of lemon-lime carbonated beverages[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2015, 63(1): 112-119.

[24] CONDE-MARTNEZ N, SINUCO D C, OSORIO C. Chemical studies on curuba (Passiflora mollissima (Kunth) L. H. Bailey) fruit flavour[J]. Food Chemistry, 2014, 157: 356-363.

[25] DEGENHARDT J, KÖLLNER T G, GERSHENZON J. Monoterpene and sesquiterpene synthases and the origin of terpene skeletal diversity in plants[J]. Phytochemistry, 2009, 70(15/16): 1621-1637.

[26] DAVIS E M, CROTEAU R. Cyclization enzymes in the biosynthesis of monoterpenes, sesquiterpenes, and diterpenes[M]∥Biosynthesis. Berlin: Springer Berlin Heidelberg, 2000: 53-95.

[27] PIANTINI U, SCHRADER J, WAWRZUN A, et al. A biocatalytic route towards rose oxide using chloroperoxidase[J]. Food Chemistry, 2011, 129(3): 1025-1029.

[28] WEDLER H B, PEMBERTON R P, TANTILLO D J. Carbocations and the complex flavor and bouquet of wine: mechanistic aspects of terpene biosynthesis in wine grapes[J]. Molecules, 2015, 20(6): 10781-10792.

[29] HOLT S, MIKS M H, DE CARVALHO B T, et al. The molecular biology of fruity and floral aromas in beer and other alcoholic beverages[J]. FEMS Microbiology Reviews, 2019, 43(3): 193-222.

[30] LIU C C, SMIT S J, DANG J J, et al. A chromosome-level genome assembly reveals that a bipartite gene cluster formed via an inverted duplication controls monoterpenoid biosynthesis in Schizonepeta tenuifolia[J]. Molecular Plant, 2023, 16(3): 533-548.

[31] HEGAZY M F, ELSHAMY A I, MOHAMED T A, et al. Terpenoid bio-transformations and applications via cell/organ cultures: a systematic review[J]. Critical Reviews in Biotechnology, 2020, 40(1): 64-82.

[32] XIAO H, ZHANG Y, WANG M. Discovery and engineering of cytochrome P450s for terpenoid biosynthesis[J]. Trends in Biotechnology, 2019, 37(6): 618-631.

Transformation Mechanisms of Volatile Terpenoids in Pulps of Orah Mandarin, Harumi Tangor and Ehime No. 38

YAN Wenyi, XIE Yating, MA Yingke, YANG Yan*, YU Ainong*

(School of Chemistry &Environmental Engineering, Hubei Minzu University, Enshi 445000, China)

Abstract：The study of transformation mechanisms of volatile terpenoids in hybrid citrus can help to reveal the aroma formation of hybrid citrus and improve the quality and flavor of processed hybrid citrus products. The pulp of three kinds of hybrid citrus, namely, Orah mandarin, Harumi tangor, and Ehime No. 38, were used as the study objects. The qualitative and quantitative analysis of terpenoids in three hybrid citrus was carried out by head space-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry (HS-SPME-GC-MS). A total of 16 terpenoids, including 3 terpenes (D-limonene, γ-terpinene, p-1,3,8-menthatriene), 7 terpenoid alcohols (linalool, p-2,8-menthadien-1-ol, terpinen-4-ol, α-terpineol, carveol, nerol, citronellol), 4 terpenoid ketones (6-camphenone, dihydrocarvone, L-carvone, isopiperitenone) and 2 other oxygenated terpenoids(rose oxide, perillyl aldehyde), were detected in the three varieties of hybrid citrus, and D-limonene and α-terpineol were detected in all the three varieties of hybrid citrus. Transformation reactions were simulated using standards of the detected terpenoids under the acid and enzymatic environments of the pulp of the three varieties of hybrid citrus. The results revealed that there were inter-transformation relationships among the 10 terpenoids under acid catalysis. Under enzyme catalysis, interconversion relationships existed among 12 terpenoids. Possible transformation mechanisms were proposed according to their transformation pathways. The study could provide a theoretical basis for the optimization of aroma preservation and aroma enhancement processes for processed products of hybrid citrus.

Keywords：hybrid citrus; citrus; aroma components; terpenoids; transformation process

doi：10.12301/spxb202500026

文章编号：2095-6002(2025)05-0065-14

引用格式：严文怡,谢雅婷,马樱柯,等.沃柑、春见、爱媛38号杂柑果肉中挥发性萜类化合物的转化机制[J]. 食品科学技术学报,2025,43(5):65-78.

YAN Wenyi, XIE Yating, MA Yingke, et al. Transformation mechanisms of volatile terpenoids in pulps of Orah mandarin, Harumi tangor and Ehime No. 38[J]. Journal of Food Science and Technology, 2025,43(5):65-78.

中图分类号：TS255.1

文献标志码：A

收稿日期：2025-01-15

基金项目：国家自然科学基金面上项目(32272456)。

Foundation：General Program of National Natural Science Foundation of China (32272456).

第一作者：严文怡,女,硕士研究生,研究方向为食品风味化学。

*通信作者：

杨 艳,女,教授,博士,主要从事食品风味化学方面的研究;

余爱农,男,教授,博士,主要从事食品化学和天然产物化学方面的研究。

(责任编辑：李 宁)