单增李斯特菌属于革兰氏阳性菌,是典型的人畜共患食源性致病菌[1]。食用受单增李斯特菌污染的食物可致脆弱患者严重感染甚至致命,威胁人类健康[2]。化学防腐剂目前仍是抑制单增李斯特菌污染的首选防控物质。然而,近年来化学防腐剂因可能诱发细菌耐药性、导致癌症及呼吸道疾病等健康风险,使其在食品工业中的应用备受争议[3-4],亟须寻找安全高效的天然抗菌剂以防控单增李斯特菌污染。

细菌素是由乳酸菌核糖体合成的抗菌肽,具有高效、安全、耐药性产生率低等优势[5-8],但其在食品防腐中的应用受到食品基质、pH值和温度等因素的限制[9]。细菌素与其他天然抗菌剂协同使用是提高其活性和稳定性的有效策略[10]。植物精油因其广谱抗菌性及安全性,在食源性致病菌防控领域具有良好应用前景[11-14],但其强烈的气味及高剂量使用特性导致的食品品质问题限制了其实际应用[15]。植物精油和细菌素协同可显著降低两者用量,并有效抑制食品基质中单增李斯特菌的生长。多项研究显示,肉桂醛和乳酸链球菌素(nisin)协同能够显著降低单增李斯特菌数量[16-17]。为此,阐明植物精油和细菌素的协同抑菌机制将有助于指导两者在食品工业中的高效应用。

目前,已有研究表明,nisin和芝麻素可协同破坏单增李斯特菌细胞膜完整性,导致细胞内溶物泄露及ATP合成受阻[18]。Chen等[9]通过形态学观察发现,nisin与茴香醛联用可显著破坏单增李斯特菌细胞形态,表现为细胞表面皱缩变形、细胞壁结构损伤以及细胞分裂异常等。由此可见,不同种类抗菌物质的协同机制有所差异,当前研究主要集中于不同抗菌物质协同作用导致的形态学损伤及细胞壁/膜等关键结构的破坏。然而,对于协同抑菌的动态过程及各组分的具体靶点与机制尚缺乏系统性研究。

本团队前期从传统低盐发酵鱼中分离的粪肠球菌Gr17,可产新型Ⅱa类细菌素——肠球菌素Gr17(4.53 kDa)。该细菌素表现出优异的理化稳定性(可耐受表面活性剂,pH值为2～10的环境及100 ℃、30 min的处理)且对革兰氏阳性菌具有较强的抗菌活性[19]。先前研究发现,肠球菌素Gr17与肉桂醛协同能显著抑制烟熏三文鱼中单增李斯特菌生长并延长货架期[20]。鉴于二者协同抑菌作用机制缺乏系统解析,本研究从细胞形态结构、细胞壁、细胞膜以及能量代谢等方面探讨肠球菌素Gr17和肉桂醛对单增李斯特菌的协同抑菌机制,为提升其在食品工业中的应用价值提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

粪肠球菌Gr17(Enterococcus faecalis Gr17),本团队从传统低盐发酵鱼制品中分离得到;单增李斯特菌CGMCC 35152(Listeria monocytogenes CGMCC 35152),中国普通微生物菌种保藏管理中心。MRS肉汤、TSB肉汤、YM培养基(生物试剂),北京陆桥技术有限责任公司;氯化钠、牛津杯、硫酸铵、琼脂,北京半夏生物有限公司;肉桂醛(cinnamaldehyde, CEO),上海麦克林生化技术有限公司;蛋白定量测定试剂盒、钾测试盒、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)测试盒、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)测定试剂盒、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)含量测试盒,南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

JY2002型电子数显分析天平,上海浦春计量仪器有限公司;H1850型高速离心机,北京天林恒泰科技有限公司;Dl-CJ-1ND-Ⅱ型超净工作台,北京东联哈尔仪器制造有限公司;GR85DF型高温灭菌锅,北京中豪莱伯科技发展有限公司;FCD-3000型鼓风干燥箱,天津市通利信达仪器厂;SPX-150B-Z型恒温培养箱,上海博讯实业有限公司设备厂;THZ-103B型恒温培养摇床,上海一恒科学仪器有限公司;HJ-6型磁力搅拌器,常州市金坛晨阳电子仪器厂;SpectraMax 13型多功能酶标仪,美国Molecular Devices公司;AKTApurifier 100型蛋白纯化系统,美国GE公司;1220 Infinity Ⅱ型高效液相色谱仪,安捷伦科技(中国)有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌株的培养

粪肠球菌Gr17在MRS肉汤中37 ℃静置培养。单增李斯特菌CGMCC 35152于TSB肉汤中以180 r/min、37 ℃过夜培养。单增李斯特菌CGMCC 35152作为后续实验的指示菌株。

1.3.2 肠球菌素Gr17的纯化

参考Liu等[19]的方法,使用硫酸铵沉淀、SP-Sepharose阳离子交换层析、Sephadex G25凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱从粪肠球菌Gr17(1×108 CFU/mL)的上清液中纯化肠球菌素Gr17。每1 000 mL的粪肠球菌Gr17中可获得约1.67 mg的肠球菌素Gr17(纯度87.4%)。

1.3.3 肠球菌素Gr17和肉桂醛对单增李斯特菌的协同抑菌实验

1.3.3.1 时间杀伤实验

使用菌落计数法测定肠球菌素Gr17和肉桂醛单独或协同处理对单增李斯特菌的抑制效果。将对数生长期(1×108 CFU/mL)的单增李斯特菌在4 ℃下离心以获得细菌沉淀,用去离子水洗涤沉淀3次,将细菌在无菌TSB肉汤中重悬至菌悬液含量约1×106 CFU/mL。分别加入78.13 μg/mL肠球菌素Gr17、4.88 μg/mL肉桂醛、78.13 μg/mL肠球菌素Gr17+4.88 μg/mL肉桂醛测定抑菌作用,仅含单增李斯特菌菌悬液的为对照组,各组均以无菌水定容至相同终体积。在37 ℃下培养24 h,每2 h收集1次,计算菌落总数。

1.3.3.2 细菌细胞外部形态观察

参考Wu等[18]的方法并稍加修改。将抗菌药物(78.13 μg/mL肠球菌素Gr17、4.88 μg/mL肉桂醛和78.13 μg/mL肠球菌素Gr17+4.88 μg/mL 肉桂醛)加入处于对数生长期(1×108 CFU/mL)的单增李斯特菌菌悬液中,在37 ℃下培养8 h。将样品用体积分数为4%戊二醛溶液固定过夜,去除戊二醛,用PBS冲洗样品3次,每次15 min。然后将样品用体积分数为4%的锇酸在4 ℃固定1～2 h,去除锇酸后用PBS漂洗3次,每次15 min。用不同体积分数的乙醇溶液(30%、50%、70%、90%、100%)对样品进行脱水处理,每次10 min,用乙酸异戊酯置换,最后使用扫描电子显微镜观察肠球菌素Gr17和肉桂醛对单增李斯特菌细胞形态的影响。

1.3.3.3 细菌细胞内部结构观察

参考Liu等[20]的方法并稍加修改,样品制备过程参照1.3.3.2节。将样品用乙醇溶液脱水,并在固定和脱水后渗透到白色树脂中,60 ℃包埋48 h。使用超微切片机在铜网上制备70～80 nm的薄切片,并用体积分数为2%乙酸铀酰染色15 min,用柠檬酸铅染色5 min,用透射电子显微镜观察细胞内组织变化。

1.3.3.4 细菌表面Zeta电位测定

参考Ning等[21]的方法并稍加修改,测定细菌表面Zeta电位。将抗菌药物(78.13 μg/mL肠球菌素Gr17、4.88 μg/mL肉桂醛、78.13 μg/mL肠球菌素Gr17+4.88 μg/mL肉桂醛)加入对数生长期(1×108 CFU/mL)的单增李斯特菌菌悬液中,未经抗菌药物处理的单增李斯特菌菌悬液为对照,在37 ℃下培养8 h。使用电位仪测定细菌表面Zeta电位。

1.3.3.5 细菌细胞壁的损伤测定

测定AKP活性以评估肠球菌素Gr17和肉桂醛对细胞壁的损伤作用。将抗菌药物(78.13 μg/mL肠球菌素Gr17、4.88 μg/mL肉桂醛、78.13 μg/mL肠球菌素Gr17+4.88 μg/mL肉桂醛)添加到对数生长期(1×108 CFU/mL)的单增李斯特菌菌悬液中,未经抗菌药物处理的单增李斯特菌悬液作为对照,在37 ℃下培养8 h,4 ℃、4 500 r/min离心10 min,每2 h收集一次上清液,用AKP测定试剂盒测定细胞外AKP活性。

1.3.3.6 细菌细胞膜通透性测定

通过检测细胞外K+和ATP含量来评估细胞膜的通透性。参考Wu等[18]的方法并稍加修改。将抗菌药物(78.13 μg/mL 肠球菌素Gr17、4.88 μg/mL肉桂醛、78.13 μg/mL 肠球菌素Gr17+4.88 μg/mL 肉桂醛)添加到对数生长期(1×108 CFU/mL)的单增李斯特菌菌悬液中,未经抗菌药物处理的单增李斯特菌菌悬液作为对照,在37 ℃下培养8 h,每2 h收集细菌悬浮液,4 ℃、4 500 r/min离心10 min。使用K+浓度测定试剂盒测定细胞外K+含量,采用ATP测定试剂盒测定细胞外ATP活性。

1.3.3.7 细菌细胞膜完整性测定

通过检测核酸、蛋白质含量和LDH活性来评估细胞膜的完整性。将抗菌药物(78.13 μg/mL肠球菌素Gr17、4.88 μg/mL 肉桂醛、78.13 μg/mL 肠球菌素Gr17+4.88 μg/mL 肉桂醛)添加到对数生长期(1×108 CFU/mL)的单增李斯特菌菌悬液中,未经抗菌药物处理的单增李斯特菌菌悬液作为对照,在37 ℃下培养8 h,每2 h收集细菌悬浮液,4 ℃、4 500 r/min离心10 min。利用酶标仪测定260 nm处吸光度,并使用BCA蛋白质测定试剂盒和LDH活性检测试剂盒检测细胞外核酸、蛋白质、LDH含量的变化情况。

1.4 数据处理

所有实验平行重复3次,数据为平均值±标准偏差。采用SPSS Statistics 25软件、单因素方差分析、描述性统计和Duncan多区间检验进行统计分析(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 肠球菌素Gr17和肉桂醛对单增李斯特菌的协同抑菌作用分析

最小抑菌浓度(MIC)和协同抑菌指数(FICI)是评估肠球菌素Gr17和肉桂醛对单增李斯特菌协同抑菌活性的指标。Duan等[22]研究表明,肠球菌素Gr17和肉桂醛对单增李斯特菌的MIC分别为1.25 mg/mL和0.16 mg/mL。1/16 MIC肠球菌素Gr17(78.13 μg/mL)+1/32 MIC肉桂醛(4.88 μg/mL)对单增李斯特菌的FICI为0.094(FICI<0.5),两者具有协同抑菌效果。时间杀菌曲线结果如图1。0～4 h,对照组和各单独处理组的菌落总数都呈上升趋势,这可能是由于低浓度的肠球菌素Gr17和肉桂醛加入初期对单增李斯特菌细胞破坏能力有限。4～24 h,相较于对照组,肠球菌素Gr17和肉桂醛单独处理组,单增李斯特菌菌落总数显著降低了1.69、1.19 lg CFU/mL。肠球菌素Gr17和肉桂醛协同处理在24 h内菌落总数分别比肠球菌素Gr17、肉桂醛单独处理组和对照组降低了4.16、4.55、6.22 lg CFU/mL。这与Chen等[9]的研究结果类似,该研究报道了在处理24 h后,nisin与茴香醛协同处理比nisin单独处理组的单增李斯特菌的活菌数降低了5.3 lg CFU/mL。8 h内,肠球菌素Gr17和肉桂醛联合处理具有显著的协同抑菌效果,与对照组相比菌落总数降低了5.18 lg CFU/mL,8 h后菌落总数趋于稳定。结果表明,协同处理组能够在短期内快速杀菌且持续抑制单增李斯特菌的生长,其抑制作用明显优于单独处理组。这可能是由于肠球菌素Gr17和肉桂醛作用靶点和作用方式存在差异,从而产生协同抑菌效果。

图1 肠球菌素Gr17、肉桂醛及其协同处理对单增李斯特菌的杀菌效果
Fig.1 Bactericidal effect of enterocin Gr17, cinnamaldehyde and their combined treatment against Listeria monocytogenes

2.2 肠球菌素Gr17和肉桂醛对单增李斯特菌细胞形态的影响

通过扫描电镜和透射电镜观察肠球菌素Gr17和肉桂醛对单增李斯特菌细胞表面(图2)和内部结构(图3)的影响。由图2可知,未处理的单增李斯特菌细胞呈现规则的短棒状,表面光滑,形态均一。单增李斯特菌经肠球菌素Gr17和肉桂醛单独作用8 h后,与对照组相比细胞出现轻微的损伤,细胞表面边界变得模糊。此外,当肠球菌素Gr17与肉桂醛协同处理8 h后,单增李斯特菌细胞受损更为严重,表面粗糙起皱、细胞变形,细胞壁和细胞膜损伤明显。由图3可知,对照组细胞内部周质空间均匀,细胞壁和细胞膜结构完整。当肠球菌素Gr17或肉桂醛单独处理后,细胞壁和细胞膜轮廓模糊,细胞表现出明显的质壁分离并伴随少量内溶物的渗出。肠球菌素Gr17和肉桂醛协同处理导致细胞壁和细胞膜结构严重受损,大量细胞质流失并出现空泡化现象。该现象与Churklam等[23]报道的结果类似,nisin和香芹酚协同处理显著改变了单增李斯特菌的形态结构,如细胞出现黏连、肿胀和裂解。扫描电镜与透射电镜结果表明,肠球菌素Gr17和肉桂醛协同处理比单独处理对单增李斯特菌的细胞形态和内部组织的损伤更大,并且观察到细胞壁表面孔洞的形成。由此可以推测,肠球菌素Gr17和肉桂醛的协同抑菌作用机理主要涉及细胞壁裂解和细胞膜损伤。

图2 肠球菌素Gr17、肉桂醛及其协同处理对单增李斯特菌细胞表面形态的影响
Fig.2 Effect of enterocin Gr17, cinnamaldehyde and their combined treatment on surface morphology of Listeria monocytogenes

图3 肠球菌素Gr17、肉桂醛及其协同处理对单增李斯特菌细胞内部结构的影响
Fig.3 Effect of enterocin Gr17, cinnamaldehyde and their combined treatment on inner structure of Listeria monocytogenes

2.3 肠球菌素Gr17和肉桂醛对单增李斯特菌表面Zeta电位的影响

Zeta电位反映肠球菌素Gr17和肉桂醛处理对细菌表面净电荷分布情况的影响,即细菌表面与周围介质的电位差,结果见图4。由图4可知,0 h时,细菌表面的Zeta电位为-27.30 mV,这是由于单增李斯特菌为革兰氏阳性菌,其细胞壁中含有带负电的磷壁酸。8 h内对照组Zeta电位无显著变化;与对照组相比,肉桂醛单独处理组Zeta电位提高但无较大差异,而肠球菌素Gr17单独处理组、肠球菌素Gr17和肉桂醛协同处理组细菌表面Zeta电位分别显著提高了14.10、20.36 mV(P<0.05),由此可见协同处理组效果显著高于细菌素单独处理组。0～2 h, 肠球菌素Gr17单独处理组、肠球菌素Gr17和肉桂醛协同处理组细菌表面Zeta电位迅速提高,2 h之后趋于平缓,表明肠球菌素Gr17与肉桂醛接触单增李斯特菌后快速吸附在其表面,并影响其表面电位。肠球菌素Gr17与nisin均为阳离子肽,能够中和革兰氏阳性菌表面的阴离子基团,例如脂磷壁酸和肽聚糖,导致细菌表面电位的增加[20,24]。而肉桂醛对于细菌表面负电荷表现出微弱的中和作用,可能是由于其对细胞膜造成损伤后,胞内钾离子泄漏使膜电位发生变化。另外,经肠球菌素Gr17和肉桂醛破坏的菌体发生聚集沉淀后,可能会导致细菌表面Zeta电位的增加。研究结果表明,肠球菌素Gr17和肉桂醛协同处理能显著提高细菌表面Zeta电位,且协同处理组优于单独处理组,这与Shi等[25]报道的研究结果较为一致。有研究报道膜电位的增加主要是由于肠球菌素Gr17这一类阳离子肽的加入,影响维持细胞稳态离子的运动,导致细胞去极化并引起Na+内流以及大量K+外流,最终破坏细胞膜的选择渗透性[24,26]。因此,肠球菌素Gr17与肉桂醛协同增强细胞膜表面Zeta电位,引起菌体相关生理变化,可能与两者对单增李斯特菌细胞壁和细胞膜的破坏作用有关。

图4 肠球菌素Gr17、肉桂醛及其协同处理对单增李斯特菌表面Zeta电位的影响
Fig.4 Effect of enterocin Gr17, cinnamaldehyde and their combination on surface Zeta potential of Listeria monocytogenes

2.4 肠球菌素Gr17和肉桂醛对单增李斯特菌细胞壁的影响

AKP是位于细胞壁和细胞膜之间的一种胞内酶,在正常情况下不能分泌到细胞外。然而,当细胞壁受损时,AKP会泄漏导致细胞外AKP活性增加[3]。因此,可利用细胞外AKP活性来评估肠球菌素Gr17和肉桂醛对单增李斯特菌细胞壁的损伤,结果见图5。由图5可知,对照组AKP活性没有显著变化,表明细胞壁是完整的。与对照组相比,8 h内肠球菌素Gr17、肉桂醛、肠球菌素Gr17和肉桂醛协同处理组的AKP活性显著提高了0.61、0.15、2.21 U/100mL。此外,肠球菌素Gr17组AKP活性高于肉桂醛组,并且协同处理组AKP活性高于单独处理组。结果表明,肠球菌素Gr17对细胞壁的破坏作用强于肉桂醛;而与单独处理组相比,协同处理组能更大程度破坏细胞壁的完整性,导致AKP的大量泄漏。肠球菌素Gr17和肉桂醛的协同作用,可能通过不同方式、多步骤结合作用于细胞壁。处于亚致死压力下的细胞,其细胞壁完整性被破坏,进而丧失了屏障功能。革兰氏阳性菌的细胞壁中含有(90%～95%)的壳聚糖。Ⅱ类细菌素可通过N-端的β-折叠区识别甘露糖磷酸转移酶系统,形成蛋白复合物加速碳水化合物在细胞膜表面的流动,导致细胞壁亲水性孔洞的形成[10]。当细胞处于亚致死压力下,肉桂醛更易进入细胞内部并作用于靶细胞膜,协助肠球菌素Gr17在细胞壁上形成孔洞,破坏细胞壁完整性。Ning等[27]同样发现,nisin和蔗糖月桂酸酯可协同破坏金黄色葡萄球菌细胞壁的完整性。由此可以推测,肠球菌素Gr17可在细胞壁上形成亲水性孔洞,与肉桂醛共同破坏单增李斯特菌细胞壁的完整性。

图5 肠球菌素Gr17、肉桂醛及其协同处理对单增李斯特菌AKP活性的影响
Fig.5 Effect of enterocin Gr17, cinnamaldehyde and their combination on AKP activity of Listeria monocytogenes

2.5 肠球菌素Gr17和肉桂醛对单增李斯特菌细胞膜的影响

2.5.1 肠球菌素Gr17和肉桂醛对单增李斯特菌细胞膜通透性的影响

细菌细胞膜具有选择透过性,正常情况下K+通过主动运输和被动运输的方式进入细胞内部并维持细胞膜内外渗透压平衡。当细胞膜受损时,细胞膜孔径增大,选择透过性消失,会导致K+的大量外流。因此,研究胞外K+浓度是评价细胞膜通透性的重要指标。肠球菌素Gr17和肉桂醛对单增李斯特菌胞外K+和胞内ATP浓度的影响见图6。由图6(a)可知,8 h内对照组中胞外K+浓度保持稳定。0～2 h,与对照组相比,肠球菌素Gr17组、肉桂醛组以及肠球菌素Gr17和肉桂醛协同处理组的胞外K+浓度均提高,分别提高至6.76、16.05、30.13 μmol/mL;在此时间段,2种抗菌物质对细胞膜通透性的影响效果最为显著。当处理时间延长至8 h时,肠球菌素Gr17组、肉桂醛组以及肠球菌素Gr17和肉桂醛协同处理组胞外K+浓度分别达到15.84、26.10、35.34 μmol/mL。相较于肠球菌素Gr17单独处理组,肉桂醛使胞外K+浓度显著提高了10.26 μmol/mL,而协同处理组比肉桂醛组显著增加了9.24 μmol/mL。结果表明,肉桂醛比肠球菌素Gr17对细胞膜的破坏性更大,且作用速率较快;而与单独处理组相比,协同处理组能更高效破坏细胞膜通透性,导致K+的大量外流。与Sharma等[28]研究结果类似,nisin与姜黄素和肉桂醛协同可增加表皮葡糖球菌细胞膜通透性,导致K+的外流。

图6 肠球菌素Gr17、肉桂醛及其协同处理对单增李斯特菌胞外K+和ATP浓度的影响
Fig.6 Effects of enterocin Gr17, cinnamaldehyde, and their combination on extracellular K+ and ATP concentrations of Listeria monocytogenes

ATP是微生物进行能量代谢的最基本载体,通过糖酵解过程在细菌的细胞壁和细胞膜中产生[14]。因此,通过检测胞内ATP浓度的变化探究肠球菌素Gr17和肉桂醛协同处理对细胞能量代谢的影响。由图6(b)可知,与对照组相比,8 h内肠球菌素Gr17组、肉桂醛组、肠球菌素Gr17和肉桂醛协同处理组的胞内ATP浓度显著降低,分别降低了77.32、89.61、133.71 μmol/mL。与胞外K+浓度结果相似,肉桂醛比肠球菌素Gr17对单增李斯特菌细胞膜通透性的影响更大,而协同处理组对菌体能量代谢的影响最强,加速细菌胞内ATP的消耗,抑制菌体的正常能量代谢并导致细菌死亡。

这一发现与Zeta电位结果一致,表明肠球菌素和细菌素协同可改变膜电位,进一步诱导膜通透性受损,伴随着胞内K+和ATP的泄漏。肠球菌素Gr17与肉桂醛协同作用对单增李斯特菌细胞膜通透性的破坏程度强于单独处理组。这可能是由于细菌素与细胞膜上的特异性受体结合,使细胞膜形成孔隙,导致细胞内溶物泄漏和质子动力(PMF)的耗散[29]。肉桂醛具有亲脂性,可与膜脂质相互作用,进而改变细胞膜的通透性、完整性、渗透调节能力或结构功能,并导致细胞内溶物的泄漏、细胞裂解和死亡[30]。此外,肠球菌素Gr17与肉桂醛在协同作用下,于2 h内迅速与细胞膜相互作用,增加了细胞膜通透性,导致K+的大量外流;随后2～4 h,二者进入胞内影响能量代谢,迅速消耗胞内ATP。当处理延长至6 h时,受损细胞因ATP耗尽试图再积累无机磷酸盐,导致细胞内和外渗透压失衡,细胞膜的通透性进一步被破坏。肠球菌素Gr17和肉桂醛分别通过受体和物理结合等方式,在细胞膜表面形成非选择性孔洞,破坏细胞膜通透性,引起K+、ATP的大量泄漏,也可能进一步诱导细胞膜完整性的破坏。

2.5.2 肠球菌素Gr17和肉桂醛对单增李斯特菌细胞膜完整性的影响

细菌细胞膜是维持细菌正常生命活动所必需的关键结构,主要负责选择性地交换物质并维持细胞形态结构,因此细胞内部分子的释放可反映细胞膜完整性的受损程度。核酸和蛋白质是存在于细菌胞内的重要生物大分子,细胞膜完整性的破坏会导致核酸和蛋白质的外渗,胞外核酸和蛋白质含量是评估细胞膜完整性的重要指标。肠球菌素Gr17和肉桂醛对单增李斯特菌核酸、蛋白质和LDH释放的影响见图7。由图7(a)可知,与对照组相比,肠球菌素Gr17、肉桂醛和肠球菌素Gr17和肉桂醛协同处理 8 h 后,单增李斯特菌的胞外OD260分别提高了0.02、0.05、0.09。由图7(b)可知,肠球菌素Gr17、肉桂醛、肠球菌素Gr17和肉桂醛协同处理8 h后,单增李斯特菌胞外释放的蛋白质质量浓度分别增加了78.84、150.83、352.41 μg/mL。LDH是存在于胞内的一种参与糖酵解途径,且与细胞能量代谢密切相关的酶。LDH的分子质量为3 kDa左右,可以自由通过细胞壁上的微孔,但不能通过具有选择透过性的细胞膜。只有当细胞膜受到严重损坏,LDH才会泄漏至胞外。由图7(c)可知,8 h内对照组的LDH活性无明显变化;与对照组相比,肠球菌素Gr17、肉桂醛、肠球菌素Gr17和肉桂醛协同处理组的LDH活性分别增加了12.17、39.99、98.70 U/100 mL,且协同处理组的LDH活性明显高于单独处理组。其中,肉桂醛单独处理组LDH活性高于肠球菌素Gr17单独处理组, 肠球菌素Gr17单独作用于单增李斯特菌时,3 h后才开始破坏其细胞膜完整性。

图7 肠球菌素Gr17 、肉桂醛及其协同处理对单增李斯特菌核酸、蛋白质和LDH 释放的影响
Fig.7 Effect of enterocin Gr17, cinnamaldehyde, and their combination on nucleic acid, protein, and LDH release in Listeria monocytogenes

结果表明,单独处理组2 h内对细胞膜完整性的破坏作用相对较弱;而协同处理组在2 h内快速破坏细胞膜的完整性,其对细胞膜的破坏作用高于单独处理组。该结论与细胞膜通透性的结果一致,相较于肠球菌素Gr17,肉桂醛展现出更强的细胞膜破坏作用,而协同处理则能够在短时间内迅速破坏细胞膜结构,并导致核酸、蛋白质和LDH等内溶物大量渗出。肠球菌素Gr17是一种Ⅱa型细菌素,其在氨基酸序列第17～32位存在α-螺旋两亲型区域,该细菌通过静电和疏水相互作用促使细胞质膜形成孔隙[19,31]。此外,肉桂醛具有亲脂性,与细胞膜上脂质相互作用可进一步促进细胞膜孔洞的形成和扩大,造成细胞生命活动必需的关键大分子物质泄漏,破坏细胞代谢、复制、转录和翻译过程,最终导致细胞的死亡[5,32]。研究表明,协同抑菌过程中对单增李斯特菌细胞膜的破坏作用主要由肉桂醛主导,肠球菌素Gr17和肉桂醛协同作用造成细菌不可逆的细胞膜结构损伤。

3 结论与展望

研究细菌素和肉桂醛的协同抑菌机制,可为充分发挥二者在食品防腐保鲜中的高效应用提供重要参考。肠球菌素Gr17与肉桂醛协同处理展现出对单增李斯特菌良好的协同抑菌活性。肠球菌素Gr17可使单增李斯特菌细胞壁形成亲水性孔洞,促进肉桂醛进入细胞内部作用于靶细胞膜,并进一步破坏细胞膜的通透性和完整性,导致K+的大量泄漏,蛋白质、核酸和LDH等大分子物质的释放。与此同时,胞内能量代谢失衡,ATP含量下降,进而影响正常生理代谢以及复制、转录和翻译过程,最终导致菌体死亡。研究旨在为更好地理解肠球菌素Gr17和肉桂醛的协同抑菌机制,并为拓展两者在食品中的应用提供理论基础。后续的研究将利用转录组和蛋白组学从基因和蛋白质水平上探究2种抗菌物质影响单增李斯特菌生长代谢的关键通路,进一步解析其复杂的协同抑菌机制。

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Study on Synergistic Antimicrobial Mechanism of Enterocin Gr17 and Cinnamaldehyde Against Listeria monocytogenes

MA Wenyu 1, SHEN Kaisheng1, LIU Qi1, DIAO Xinjie1, LIU Guorong1,2,*

(1.School of Food and Health, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048;2.Key Laboratory of Geriatric Nutrition and Health, Ministry of Education/ Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048)

Abstract：Synergistic antimicrobial effects of bacteriocins and essential oils are an effective way to address food safety issues caused by foodborne pathogens, but the related synergistic antibacterial mechanisms are still unclear. This study investigated the synergistic antibacterial mechanisms of enterocin Gr17 and cinnamaldehyde against Listeria monocytogenes from the perspectives of morphological structure, cell wall, cell membrane and energy metabolism. Time-killing experiments showed that enterocin Gr17 and cinnamaldehyde synergistically inhibited the growth of Listeria monocytogenes in a time-dependent manner, with a reduction of bacterial counts by 6.22 lg CFU/mL for 24 h. Scanning electron microscopy and transmission electron microscopy analysis revealed that enterocin Gr17 and cinnamaldehyde synergistically disrupted the morphology and internal tissue of cells, resulting in the disintegration of cell structure. Alkaline phosphatase activity and Zeta potential analysis indicated that enterocin Gr17 and cinnamaldehyde synergistically disrupted the cell wall integrity of Listeria monocytogenes via disrupting its surface potential and targeting cell wall constituents. The leakage of K+ and adenosine triphosphate and the massive release of nucleic acids, proteins, and lactate dehydrogenase indicated that enterocin Gr17 and cinnamaldehyde synergistically formed non-selective pores in the cell membrane of Listeria monocytogenes, disrupted membrane permeability, further inhibited energy metabolism, and ultimately caused irreversible structural damage to the membrane integrity and cell death. Notably, enterocin Gr17 mainly targeted and destroyed the cell wall, while cinnamaldehyde primarily acted on the cell membrane. Their synergistic interaction exacerbated the loss of structural integrity in both the cell wall and membrane, culminating in compromised energy metabolism. This study provided a theoretical reference and scientific basis for understanding the synergistic antimicrobial mechanism of natural antimicrobial agents.

Keywords：enterocin Gr17; cinnamaldehyde; foodborne pathogens; synergistic antibacterial mechanism; natural antimicrobial agent

doi：10.12301/spxb202400381

文章编号：2095-6002(2025)05-0046-10

引用格式：马文誉, 申凯升, 刘琦, 等. 肠球菌素Gr17和肉桂醛联用对单增李斯特菌的协同抑菌机制研究[J]. 食品科学技术学报,2025,43(5):46-55.

MA Wenyu,SHEN Kaisheng,LIU Qi, et al. Study on synergistic antimicrobial mechanism of enterocin Gr17 and cinnamaldehyde against Listeria monocytogenes[J]. Journal of Food Science and Technology, 2025,43(5):46-55.

中图分类号：TS201.3

文献标志码：A

收稿日期：2024-06-08

基金项目：国家自然科学基金面上项目(31871772); 广东省基础与应用基础研究基金项目(2022A1515140021)。

Foundation：National Natural Science Foundation of China(31871772); Guangdong Provincial Basic and Applied Basic Research Fund Project(2022A1515140021).

第一作者：马文誉,女,硕士研究生,研究方向为食源性致病微生物控制。

*通信作者：刘国荣,女,教授,博士,主要从事微生物活性代谢产物方面的研究。

(责任编辑：张逸群)