抗菌肽(antimicrobial peptides,AMP)是自然界中广泛存在且具有抗菌功能的多肽,它们不仅在生命科学和医学研究领域发挥着不可或缺的作用,同时在食品保质和安全领域也显示出较大潜力[1-3]。细菌生物膜的形成大大增强了细菌对抗生素的抵抗能力[4-5]。C2E (cyclic-di-GMP)是一种广泛存在于革兰氏阴性菌中,可以调节多种细胞过程包括毒力因子和基因表达的信号分子[6-8]。在结构上,C2E是一个仅含有2个鸟嘌呤碱基并且通过核糖和磷酸连接而成的环状多肽。在细菌中,某些信号通过合成或降解环二鸟苷单磷酸来传递。MrkH蛋白是一种依赖于C2E调控的经典转录激活剂,它同时激活III型菌毛的基因簇和mrkHI操纵子。在这个正反馈循环中,MrkH激活自身的产生,在有利环境下确保细菌MrkH蛋白快速产生、Ⅲ型菌毛的表达及生物膜的形成[9]。这种调控机制为从宏基因组数据中筛选能够抑制该通路的多肽提供了理论依据。

本研究旨在利用先进的计算方法和机器学习技术,构建预测模型,筛选出具有抑制MrkH-C2E细菌转录关键蛋白或信号通路的抗菌肽,以干扰和控制生物膜的形成,实现从基因组数据中高通量筛选极具潜力的食品抗菌剂,为食品安全和抗生素耐药性问题提供新的解决方案。模型拟选取氨基酸序列和理化性质作为特征指标,结合注意力(attention,ATT)模型、长短期记忆 (long short term memory,LSTM) 模型和卷积神经网络(convolutional neural networks,CNN) 3种深度学习方法对输入数据进行筛选。此外,为了获得筛选结果在土壤微生物菌群中的含量,分析筛选结果的丰度信息,以提供输出结果在细菌中具体的含量。并通过抑菌实验验证筛选结果对克雷伯氏细菌菌株和食源性致病菌的抗菌活性,同时使用在线预测工具,检测多肽的细胞毒性及其溶血性[10]。研究旨在基于计算和实验评估结果预测可安全应用于食品的抗菌肽,为食品抗菌提供新的策略。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

肺炎克雷伯氏菌菌株,中国医学细菌菌种保藏管理中心;金黄色葡萄球菌、大肠杆菌,北京工商大学生物细胞工程实验室。LB固体培养基,北京奥博星生物技术有限责任公司。基因组提取试剂盒,天根生化科技(北京)有限公司。N,N′-二异氰酸亚胺(纯度99.5%)、1-羟基苯并三唑(纯度99%)、哌啶(纯度97%)、二甲基亚砜(纯度99.7%)、二甲基甲酰胺(纯度99.9%),北京化工厂。

1.2 仪器与设备

全基因组可视化分析平台(操作系统:Ubantu 22.04,CPU:Xeon Scalable Processors, GPU:NVIDIA DGX A100),美国Dell公司。Varioskan LUX型酶标仪,美国Thermo Scientific公司。NextSeq 550型高通量测序平台,美国Illumina公司。

1.3 实验方法

1.3.1 数据收集与清洗

1)AMP数据。来自公开可用的AMP数据库,如APD (Antimicrobial Peptide Database)、CAMP (Collection of Anti-Microbial Peptides)和DBAASP (Database of Antimicrobial Activity and Structure of Peptides)等数据库以及先前研究提供的AMP数据。AMP数据中涵盖了不同来源的各种AMP序列[11-17],确保了AMP数据的多样性。使用CD-HIT程序去除数据冗余后,得到1个包含3 600条AMP序列的阳性数据集。这些序列的长度从13～154个氨基酸不等。排除了长度超过100个氨基酸的序列,最终得到3 167个非冗余的AMP序列,序列氨基酸长度具有特定的分布。随机选取1 500个AMP数据组成训练数据集,剩余数据组成独立的测试数据集。

2)非AMP数据。在Uniprot数据库中设置“亚细胞定位”过滤器为细胞质,并移除包括抗菌、抗生素、抗病毒、抗真菌、效应物或分泌关键词匹配的条目。选择长度小于100个氨基酸的肽段,去除数据冗余。去除冗余序列后,与AMP数据集进行比较,删除两者之间的公共序列。最终,保留了3 167个非抗菌肽序列。随机选择1 500个序列组成非AMP的训练数据集,剩余数据组成阴性测试数据集。

3)宏基因组数据。基因组数据来源于云南省温带森林区域次表层的土壤样本。这是一种肥沃的土壤类型,具有良好的排水与保水能力,该地区周围有一定的草本植物和灌木覆盖。使用高通量测序平台进行测序,得到1个包含123 092个序列的基因组文件。对于基因组数据,在蛋白质模拟消化软件中使用胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K模拟酶消化。确保小型开放阅读框(small open reading frame,sORF)中的数据是具有活性的蛋白质数据。经过训练的模型通过分析sORF中的数据,从而筛选出潜在的抗菌肽。软件参数设置为最小碎片质量750 Da,最大碎片质量3 750 Da。

1.3.2 氨基酸的特征提取

每个氨基酸残基由1个21位二进制向量表示。这种编码方法将氨基酸的序列信息转换成为数字形式,使计算机能够对其进行处理和分析。编码中的每个字节表示氨基酸的不同属性或位置信息,从而使每个氨基酸具有唯一的二进制编码表示。 “100000000000000000000”可以被模型读取为丙氨酸,在氨基酸序列编码的基础上,同时编码氨基酸的物理化学性质,包括亲水性、疏水性和电荷。(-1,0,+1)代表电荷,(-3.5,1.8,-4.5)表示氨基酸的两亲性,最终用这些数值构成了一个特征向量。并将这些向量组合成BLOSUM62(blocks substitution matrix 62)矩阵。

1.3.3 DLMAMP预测模型组建

1)CNN模型。卷积神经网络分类器由输入层、输出层、池化层、2个卷积层、3个密集的全连接层、1个展开层和1个丢弃层组成。卷积层使用3×3矩阵进行操作,并采用2×2的最大池化层以降低维度。为减轻过拟合,使用丢弃率设置为0.5的丢弃层。在模型中,第1个卷积层的filters参数设置为64,表示这一层有64个卷积核,每个核负责检测输入数据中的不同特征;kernel_size参数设置为3,意味着每个卷积核的大小为3,这表明每次卷积操作考虑输入序列中连续3个时间步长的窗口;padding参数设置为same,表示使用填充来保持输入和输出大小一致。第2个卷积层配置了32个大小为3的卷积核,并使用填充以确保输出大小与输入匹配。第3个卷积层由64个大小为3的卷积核组成,也采用了填充。

3个卷积层堆叠起来,从输入序列中提取局部特征。每个卷积核在输入序列上滑动并进行卷积操作以捕捉不同的模式和特征。卷积层的层次结构使模型能够自动从数据中学习抽象特征,这些特征在随后的全连接层中进一步处理,以支持分类任务。通过这种方式,卷积神经网络擅长处理序列数据。若将模型的输入样本设为x,那么卷积层中的操作见式(1)～式(3)。

Re lu(x)=max (0,x);

(2)

式(1)～式(3)中,w表示卷积核的大小,表示第k个卷积核的权矩阵,P*q表示矩阵的大小。

2)LSTM模型。包含1个输入层、1个包含16个LSTM单元的LSTM层、1个展开层、1个密集层和1个输出层。模型从输入层接收序列特征数据,并处理这些数据以提取重要信息。在LSTM层之后,使用展开层将LSTM层的输出展平为一维向量。在展平层之后是包含10个神经元的密集层。密集层接收展平层的输出作为输入,并执行线性变换和激活函数以生成特征向量。最后,输出层包含2个神经元,使用Sigmoid激活函数。输出层用于二元分类任务,提供2个类别的概率分布。

3)ATT模型。将LSTM模型中的LSTM层替换为注意力层,其余设置均相同。

将研究建立的DLMAMP模型与其他经典抗菌肽预测模型,ClassAMP-SVM[17]、ClassAMP-RF[17]、CAMP-RF[13,16]、CAMP-SVM[13,16]、CAMP-ANN[13,16]、AMPscanner[17]、iAMP-2L[9]、AMPlify[11]模型对比,分析该模型的抗菌肽筛选性能。

1.3.4 模型性能评估

通过结合LSTM模型、ATT模型和CNN模型来构建一个用于预测抗菌肽的集成深度学习框架。该框架的CNN层被设计用于有效捕获输入数据的局部特征,而LSTM层用于处理序列的全局信息。这种组合使模型能够同时考虑本地和全局信息,从而更全面地理解输入数据。注意力机制的加入使模型能够在序列处理过程中更多地关注与抗菌肽相关的关键特征,从而提高效率和性能。同时,引入准确率、召回率、特异性等参数[式(4)～式(9)]对模型的性能进行验证。

准确率

(4)

召回率

(5)

特异性

(6)

精准度

(7)

马修斯相关系数=

(9)

式(4)～式(9)中,Tn为真阴性,Tp为真阳性,Fn为假阴性,Fp为假阳性。

1.3.5 土壤中抗菌肽和微生物群丰度测定

利用Kraken 2软件将宏基因组数据与细菌数据库进行比对,确定宏基因组数据中基因数据的来源及相应的细菌丰度。通过将sORF数据和预测结果与原始基因进行比对,最终确定能产生特定肽段的细菌及其丰度。

1.3.6 分子对接设计

利用Autodock Vina软件进行分子对接设计。在Vina可视化操作平台中,对蛋白质进行脱水和加氢处理,并将结果保存为pdbqt格式。箱体盒子被放置在蛋白质的活性口袋上,每个肽经过8次对接,最终选择结合能绝对值最大的构象作为最终结果。随后利用Discovery Studio获得配合物的三维对接结构,包括氢键、电荷分布和疏水相互作用。

1.3.7 分子动力学模拟

采用GROMACS 2020.3软件进行分子动力学模拟。利用amber99sbildn力场和通用琥珀力场(GAFF)分别生成蛋白质和配体的参数和拓扑结构。优化模拟盒子的尺寸,使蛋白质的每个原子与盒子的距离大于1.0 nm。然后,以密度为1 g/cm3的水分子填充盒子。为保证模拟系统为电中性,用Cl-和Na+离子取代水分子。采用最陡下降法,对5.0×104步骤进行能量优化,使整个系统的能量消耗最小化,最终减少整个系统中不合理的接触或原子重叠。在能量最小化之后,使用NVT组件在300 K下进行100 ps的第一相平衡,以稳定系统的温度。在0.1 MPa和100 ps的条件下,用NPT系统模拟第二相平衡。模拟的主要目标是优化目标蛋白与溶剂和离子之间的相互作用,使模拟系统完全预平衡。所有的MD模拟都是在温度为300 K,压力为1个大气压的等温和等静力集合下进行的,速度为30 000 ps。温度和压力分别采用V-rescale和Parrinello-Rahman方法控制,温度和压力耦合常数分别为0.1、0.5 ps。采用Lennard-Jones函数计算范德华力,非键截断距离设为1.4 nm。所有原子的键长由LINCS算法约束。采用粒子网格-埃瓦尔德法计算了远距静电相互作用,傅里叶间距为0.16 nm。在经过100 ns的模拟后,对结果进行均方根偏差、 旋转半径、均方根波动和溶剂可及表面积计算。

1.3.8 固相合成实验

采用Fmoc(Fmoc chemistry strategy)化学策略对筛选结果进行固相合成[18]。使用装有Fmoc的固相树脂在体积分数为20%的哌啶溶液中保护C-末端氨基酸。N,N′-二异氰酸亚胺与1-羟基苯并三唑(DIC-HOBt)作为活化试剂促使氨基酸之间完成耦合,耦合反应均持续1 h,完成后使用二甲基亚砜(DMSO)和二甲基甲酰胺(DMF)交替洗涤。去保护和耦合反应结束后对固相载体进行洗涤,去除未反应的氨基酸和副产物。重复耦合-洗涤过程直至多肽合成完毕。

1.3.9 抗菌活性验证

选取肺炎克雷伯氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为验证对象。3种菌株均被复苏于LB固体培养基平板上,并在37 ℃条件下孵育16～18 h,以确保充分生长。选取单个健康菌落,转接至液体LB培养基中,并在37 ℃、220 r/min的摇床上振荡培养至对数生长期[19]。

采用双缩脲法测定饱和肽液质量浓度[20],然后使用去离子水将肽液分别稀释至125.0、90.5、70.5、50.5、31.5、0 μg/mL并编号为1～6组。使用 0.22 μm 的滤膜过滤除菌后取1 mL加入液体LB培养基中,与菌液共同孵育。使用酶标仪测定吸光度,波长设置为600 nm,每4 h测定1次菌液的浑浊程度并记录OD600。通过绘制光密度曲线,从而测定肽液对于3种细菌的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)。通过计算菌落总数,研究不同多肽质量浓度对细菌生长的影响。所有实验均在无菌条件下进行,避免交叉污染。实验采用的菌株培养条件及操作细节均依照国际标准化操作程序执行。

2 结果与分析

2.1 多模型对比结果分析

图1展示了不同模型在相同独立测试数据集上的曲线下面积(area under curve, AUC)。AUC通过描绘真正例率(true positive rate,TPR)和假正例率(false positive rate,FPR)之间的关系来展示分类器在不同阈值下的表现。结果表明,本研究提出的DMLAM模型取得了较好的预测结果,AUC为0.99。与以往的深度学习模型CAMP-ANN、AMPlify和iAMP-2L等相比,DLMAMP在数据预处理和特征提取阶段采用了新颖的组合方式,提高了模型对于复杂数据结构的理解能力,从而提升了整体的预测精度。通过优化网络结构和训练策略,模型在计算上更为高效,降低了对硬件的依赖,使得模型在不同的环境下都能够稳定运行。针对过拟合问题,正则化技术的引入有效提升的了模型的泛化能力。与传统机器学习模型,如ClassAMP和CAMP相比,DMLAMP在处理大规模数据集和识别复杂模式方面具有明显的优势。通过优化网络结构和训练策略,模型在计算上更为高效,与其他几种模型比较,在进行筛选的单位时间(1 s)内模型能够处理数据量为500 Mb左右的sORF文件,且GPU显存占用为6 G左右,对比其他几种模型减少了10%。针对过拟合问题,正则技术的引入有效提升了模型的泛化能力(图1)。优化后在检验数据集上的性能指标对比以往的模型具有3%～5%的提升。传统模型往往依赖于手动提取特征,而DMLAMP能够自动学习和提取高级特征,这提高了模型处理复杂数据的能力,这在处理高维度数据时尤为重要,能够显著提升预测的准确性和模型的鲁棒性。通过独立测试集,进行10倍交叉测试,测试9种经典抗菌肽预测方法的性能(表1)。本研究提出的模型达到了96.5%的准确率、98.7%的精准度和99.2%的特异性,均优于其他预测模型。这些结果表明,本模型是完全可行和有效的。

2.2 模型预测结果分析

将小型开放阅读框数据与抗菌肽数据进行比对,去除已知的抗菌肽序列,剔除冗余序列后得到1个包含2 537 905个序列的待预测数据集。将该数据集输入模型中,得到了需要实验验证的258 749个序列。随后将模型评分在0.90～0.99的312个多肽使用ToxinPred141(http:∥crdd.sodd.net/raghava/toxinpred)和HemoPred(http:∥codes.bio/hemopred)在线预测工具评估模型输出结果的毒性和溶血潜力。最终得到了9个既无毒性也无溶血性的多肽,分别为Arg-Lsy-Gln-Gly-Phe-Arg-Arg、Met-Thr-Lys-Trp-Trp-Ala、Ser-Phe-Arg-Arg-Phe-Thr-Tyr-Gly-Asn-Leu-Val-Thr-Thr-Phe-Thr-Ser-Ser-Lys、Gly-Thr-Ala-Trp-Arg-Trp-His-Tyr-Arg-Ala-Arg-Ser、Val-Pro-Tyr-Leu-Leu-Leu-Pro-His-Ser-Val-Ser-Ala-Leu-Val-Leu-Thr-Phe-Arg-Arg、Arg-Val-Ala-Lys-Leu-Pro-Lys-Pro-Leu、Leu-Cys-Leu-Ile-Gln-Asn-Ile-Lys-Thr-Phe-Asn-Asn-Gly-Ser-Leu-Gly-Ser-Arg-Ile-Asp-Glu-Glu-Arg-Ser-Ile-Gly、Ala-Thr-Asn-Ile-Pro-Phe-Lys-Val-His-Phe-Arg-Cys-Lys-Ala-Ala-Phe-Cys、Asn-Phe-Gln-Gln-Arg-Ile-Ser-Trp-Phe-Ser-His-Arg,记为P1～P9,进行后续的分子对接与分子动力学模拟验证。

使用Kraken2软件对所有原始数据进行注释,将预测结果与原始数据进行对比。结果显示,筛选出的多肽主要来源于荧光假单胞菌、黑曲霉菌、哈茨木霉、马弗链霉菌、根霉菌、大肠杆菌等土壤微生物。图2展示了筛选结果(P1～P9)与细菌种群之间的关系映射。通过桑基图可视化分析,可以清晰地观察到9种筛选结果与一种或多种细菌之间的丰度差异,流的宽度代表了相应的肽在不同细菌种群中相对丰度的高低,P1在荧光假单胞菌中有较高的丰度,P2在哈茨木霉菌中有较高的丰度,P3在根霉菌中有较高的丰度,P4 、P7和P9在大肠杆菌中有较高的丰度,P5和P6在黑曲霉菌中有较高的丰度,P8在马弗链霉菌中有较高的丰度。图2括号中的数据代表了特定的细菌种群中P1～P9的总丰度,这种表示法揭示了各肽类在不同细菌种群中的分布格局,有助于进一步筛选和验证具有潜在抗菌效力的肽类分子。

2.3 分子对接结果分析

生物膜是一种由细菌分泌的黏性物质构成的保护层,能够让细菌群体在各种环境条件下存活,并增强其抗药性[21-22]。理解抗菌肽如何破坏这一防御机制是开发新型抗感染策略的关键。目前已有部分抗菌肽被发现能够干扰生物膜的形成,它们可通过影响细菌的群体感应系统,来减少细菌的生物膜形成[23]。一些抗菌肽还可以直接与生物膜成分相互作用,破坏其结构或干扰生物膜内的水通道和营养物质传输。此外,抗菌肽也可能通过抑制生物膜相关的酶活性或细菌黏附分子的表达来阻止生物膜的形成和维护[24]。研究表明,调节C2E水平或阻断其与MrkH等关键蛋白的相互作用,能够显著影响生物膜的稳定性和功能[25]。

本研究对肽与MrkH蛋白分子的相互作用进行了评估。使用Autodock Vina将模型中得分最高的肽对接到MrkH蛋白(PDB ID:5KEC)的活性口袋中,结果见表2。将所有对接结果与MrkH蛋白的原配体进行比较。由表2可知, 多肽P1、P4、P5、P9的结合能为-37.999、-45.530、-44.451和-38.547 kJ/mol,与C2E配体(-36.819 kJ/mol)相比具有更好的结合能力[26-27]。故后续验证中选取评分最高的P4多肽进行验证。图3为肽-蛋白相互作用与原有配体-蛋白相互作用的可视化对比,其中突出了目标蛋白质-配体复合体的分子结合位点和电荷表面电位。图3(a)、图3(b)二维展示了原有配体和P4多肽与蛋白质活性位点关键氨基酸的相互作用。图3(c)、图3(d)则展示了配体-蛋白质复合体的三维分子模型。由图3(a)可知,MrkH蛋白与C2E配体之间的相互作用主要通过氢键介导。位于配体一侧的残基LYS63和ARG65通过氢键与氨基和磷酸基团相互作用;另一侧,残基PHE208、PRO112和ASP143也通过氢键与氨基和碳原子相互作用。可以推断出,肽与蛋白质的结合主要是由氢键、静电相互作用和疏水相互作用驱动的,并且氢键起主导作用。P4与其他肽相比具有更强的结合能。由图3(b)可知,P4与MrkH蛋白结合能可能受到自身与蛋白结合袋之间氢键数量的影响[28-29]。考虑到化合物的结构和性质,多肽和C2E之间的结合位点存在差异是可以预料的[30]。

2.4 分子动力学模拟结果分析

用GROMACS 2020.3软件对对接结果中亲和力最高的P4进行动力学模拟,并与原有配体C2E的模拟结果进行对比,结果见图4。研究采用均方根偏差(RMSD)来量化结构偏差,当蛋白质构象偏离其初始结构时,这种变化的程度可以很容易地在分子动力学模拟过程中通过RMSD推断出来。较小的RMSD表明配体-受体结合稳定,而较大的RMSD可能表明显著的结构变化或不稳定[31]。由图4(a)可知,C2E与MrkH蛋白的复合物(MrkH-C2E)和P4与 MrkH蛋白的复合物(MrkH-P4)曲线都表现出相对的稳定性,在整个模拟过程中只有很小的波动,这通常表明主要的分子结构没有发生变化[32-34]。复合物MrkH-C2E的平均RMSD为0.44 nm,复合物MrkH-P4的平均RMSD为0.52 nm, P4与MrkH结合引起的结构调整比原配体稍大。但100 ns的RMSD实验结果显示,MrkH-P4复合物的轨迹处于稳定状态,与MrkH结合位点有很强的联系。且100 ns内RMSD的数值没有迅速上升,这表明模拟的分子并没有迅速偏离其初始结构[35-36]。

均方根波动(RMSF)通过测量轨道内原子位置的标准偏差[图4(b)],来确定蛋白质中单个残基的平均柔韧性。P4和C2E的c域(残基192～198)有较大的波动。观察该区域的结构柔韧性发现,P4和C2E的RMSF非常相似,ASP192残基的RMSF值分别为0.44、0.38 nm;残基62处,P4和C2E的RMSF值分别为0.31、0.37 nm。

为了研究分子动力学模拟过程中蛋白质表面与溶剂水的有效接触面积,计算溶剂可及表面积(solvent accessible surface area, SASA)[图4(c)]。通过比较SASA发现,在100 ns分子动力学模拟过程中,P4与MrkH蛋白形成了高度稳定的复合物,类似于MrkH-C2E蛋白复合物的稳定性[37]。

旋转半径(Rg)可进一步验证复杂结构的稳定性、紧凑性、可折叠性和展开能力。在100 ns的模拟过程中,沿着分子对接轨迹对2种复合物进行了分析,见图4(d)。C2E的Rg平均值为2.083,P4的平均值为2.080,这一接近的数值表明2种复合物在空间结构的紧凑性或整体构型上可能非常相似。半径体积反映的是复合物在溶液中尺寸的指标,较小的Rg通常意味着结构更为紧凑。因此,几乎相同的Rg表示P4和C2E在与MrkH蛋白相互作用时,可能采取了类似的三维形状,表明它们可能具有相似的结合特性和潜在的生物效应。

2.5 抗菌肽抑菌活性分析

不同质量浓度的P4溶液的抑菌活性见图5。由图5可知,该多肽不仅对肺炎克雷伯氏菌具有抑制作用,同时还对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有抑制作用。其中1组抑菌圈直径最大,分别为13.8、12.5、13.1 mm。添加不同质量浓度的P4溶液后不同菌液的光密度和菌落总数见图6。由图6可知,随着P4质量浓度的降低,受试菌被抑制的效果亦逐渐减弱。P4对肺炎克雷伯氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC分别为31.5、50.5、70.5 μg/mL。通过测定添加P4溶液的菌液菌落总数和OD600的相关性发现,不同质量浓度的多肽溶液对细菌生长产生了不同的影响。未添加P4溶液的肺炎克雷伯氏菌整个生长阶段的OD600在0.4～2.5波动,细菌菌落总数与OD600呈正相关,且在14 h处到达对数生长期,20 h后到达稳定状态。金黄色葡萄球菌整个生长阶段的OD600在0.4～1.1波动,10 h进入对数生长期,20 h后达到稳定状态。大肠杆菌整个生长阶段的OD600在0.1～0.7波动,4 h进入对数生长期,24 h后到达稳定状态。添加了P4溶液后的菌液均展现出不同程度的生长抑制。综合OD600、CFU计数与MIC结果,P4多肽显示出了一定的抗菌活性。

3 结 论

本研究建立了一种预测抗菌肽的新模型,该模型结合了LSTM、CNN、ATT 3个独立的深度学习分类器。在同一测试数据集下与其他预测模型相比,本模型精准度达到98.7%、准确率96.5%、召回率 91.9%、F1-score 95.2%、特异性99.2%。应用该模型成功地筛选出了多个具有抗菌潜力的多肽。通过分子对接与分子动力学模拟深入分析了P4(Gly-Thr-Ala-Trp-Arg-Trp-His-Tyr-Arg-Ala-Arg-Ser)的结合特性。结果显示,P4展示出了比MrkH蛋白原有配体更强的结合力,而且通过分子动力学的模拟也证明了这一结果。通过抗菌活性检测,P4不仅对肺炎克雷伯氏菌表现出抗菌活性,MIC为31.5 μg/mL。同时也对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌展现出一定的抑制作用。此外,抑菌圈实验结果进一步证实了P4对细菌生长的影响。本研究建立的高通量预测筛选方法,旨在为不同条件下微生物菌群中筛选抗菌肽的研究提供参考。

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Screening Antimicrobial Peptides from Metagenomes Based on Deep Learning and Molecular Simulation

TIAN Yuan, HAN Aiping, XU Chunming*

(School of Light Industry Science and Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

Abstract： Antimicrobial peptides are a type of peptide capable of exerting antibacterial functions by interacting with bacterial cell membranes or intracellular biomolecules, thereby disrupting bacterial physiological processes and ultimately leading to bacterial death. A novel deep learning model was constructed to screen antimicrobial peptides from soil metagenomic data and validated the screened peptides using techniques such as molecular docking and molecular dynamics simulations. The model demonstrated an outstanding performance with a precision of 98.7%, an accuracy of 96.5%, a recall rate of 91.9%, an F1-score of 95.2%, and a specificity of 99.2%, showcasing excellent efficiency, interpretability, and practical application value alongside robust generalization capabilities. After training, the model successfully identified several short peptides with significant antimicrobial potential, with a subset chosen for further investigation. The findings revealed that the screened peptide Gly-Thr-Ala-Trp-Arg-Trp-His-Tyr-Arg-Ala-Arg-Ser could effectively attach to the bacterial transcription regulator protein MrkH, exhibiting inhibitory effects on Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, and Staphylococcus aureus. This study aimed to provide a theoretical basis for the development and application of new antimicrobials in the food industry by integrating deep learning with molecular simulation technologies.

Keywords： machine learning; molecular docking; molecular dynamics simulation; antimicrobial peptides; antimicrobial activity validation

doi：10.12301/spxb202300710

文章编号：2095-6002(2025)04-0138-12

引用格式：田源,韩爱萍,徐春明.深度学习结合分子模拟高效筛选宏基因组数据中的抗菌肽[J]. 食品科学技术学报,2025,43(4):138-149.

TIAN Yuan, HAN Aiping, XU Chunming. Screening antimicrobial peptides from metagenomes based on deep learning and molecular simulation[J]. Journal of Food Science and Technology, 2025,43(4):138-149.

中图分类号： TS201.6

文献标志码： A

收稿日期： 2023-11-21

基金项目： 国家自然科学基金资助项目(30471225);国家重点研发计划项目(2023YFD2100202)。

Foundation: National Natural Science Foundation of China (30471225); National Key Research and Development Program of China (2023YFD2100202).

第一作者： 田 源,男,硕士研究生,研究方向为生物信息学。

*通信作者： 徐春明,男,副教授,博士,主要从事生物过程方面的研究。

(责任编辑：张逸群)