肝脏代谢的酒精量占人体总摄入量的90%～98%,对维持酒精代谢平衡至关重要[1]。过量饮酒使酒精在肝脏中过度积累,引起肝组织形态和功能的改变、氧化应激及免疫系统的异常应答,这些因素共同作用,导致了酒精性肝损伤(alcoholic liver injury,ALI)[2-3]。ALI在全球,特别是中国,是引起高发病率和死亡率的主要原因。因此,为了降低ALI的发病率和死亡率,限制酒精摄入和实施有效的预防与治疗策略显得极为关键。

乙醇由肠道吸收,主要在肝细胞中分解代谢[4]。乙醇主要由乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)转化为乙醛,再由乙醛脱氢酶(acetaldehyde dehydrogenase,ALDH)转化为乙酸,最终分解为水和二氧化碳。少数乙醇通过线粒体酶氧化途径代谢成乙醛,并产生活性氧(reactive oxygen species,ROS)。此外,过氧化氢酶直接催化乙醇转化为乙醛和水[5]。过量饮酒会导致乙醇代谢产生的氧化代谢物在血液和肝脏中积累,引起氧化应激。乙醛与生物分子结合形成免疫原加合物,可能诱发肝细胞损伤和炎症[5]。另外,由于乙醛介导的谷胱甘肽(glutathione,GSH)减少,肝脏的抗氧化剂清除系统受损,加剧氧化应激损伤[6]。因此,提升抗氧化能力是缓解ALI的关键。

植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum),作为一种益生菌,具有抗氧化、减少内毒素积累、调节肠道菌群等健康益处[7-8]。众多研究也支持植物乳植杆菌对若干疾病的积极影响[9],为糖尿病[10]、结肠炎[11]和肾衰竭[12]等病症的治疗提供了思路。特别地,该菌种能预防肝脏脂肪变性和酒精引起的慢性损伤[13]。如Gan等[7]的研究报道了植物乳植杆菌HFY09通过提升肝脏抗氧化酶活性和降低炎症因子水平显著改善乙醇诱导的肝损伤。Li等[14]的研究进一步证实,植物乳植杆菌J26可通过提高短链脂肪酸水平激活Nrf2信号通路,缓解肝脏氧化应激,从而减轻酒精诱导的肝损伤。口服植物乳植杆菌能通过多靶点作用治疗ALI,且无明显副作用[15]。Ding等[13]发现,植物乳植杆菌ZY08能降低血浆内毒素水平,恢复肠道菌群稳态,显著改善酒精相关性脂肪肝和肝损伤。同时,Lee等[16]的研究表明,植物乳植杆菌FB091能减少肝细胞气球样变和炎性细胞浸润,并通过增强ADH活性促进酒精代谢。目前,关于其对ALI有辅助保护作用的研究多集中于修复肠屏障、调节肠道菌群、增强转氨酶活性等方面[17],而直接利用其酒精降解功能来减少人体酒精摄入和提升肝脏抗氧化能力的研究相对较少。

相较于现有研究,本研究首先从传统发酵食品中分离出16株植物乳植杆菌,评估其降解乙醇能力以及对ADH和ALDH活力的影响,筛选出酒精代谢速率高、可降低肝脏氧化应激水平的植物乳植杆菌。其次,测定植物乳植杆菌的抗氧化、耐酸、耐胆盐能力,筛选出能力优良的植物乳植杆菌。然后,建立小鼠酒精性肝损伤模型,研究植物乳植杆菌对酒精性肝损伤的保护作用。进一步对小鼠肝组织基因表达量进行研究,探明菌株对ALI产生辅助保护作用的机制。希望研究可为开发对ALI有辅助保护作用的保健食品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验动物:3周龄健康雄性昆明小鼠(20 g±2 g), 均购于辽宁长生生物技术股份有限公司,许可证号:SVXK(辽)2020-0001,饲养于沈阳农业大学实验动物中心SPF级实验室。动物实验经沈阳农业大学实验动物中心伦理委员会批准,伦理审批号:2023102702。

海王牌金樽冲剂,购于东北大药房。

实验菌株:植物乳植杆菌FS5-5、FSDJ-15-1、WW、DQ16-2、DLDJ-J-2-2、AS1-2、FSDJ-5-3、YB2-1、CY1-2、DQ3-1-34分离自东北传统发酵豆制品(大豆酱),植物乳植杆菌37DD1-1、20HX11-1、37HX2-3-2、37SJ6-3、37SJ1-6、37DL1-1分离自东北传统发酵蔬菜(酸菜),均保存于沈阳农业大学食品科学学院微生物菌种资源库。

2,2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)[2,2′-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS]、无水乙醇、浓硫酸、重铬酸钾、果糖、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotina-mide adenine dinucleotide,NADH)、吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate,PMS)、四唑氮蓝(nitro-blue tetrazolium,NBT)、牛磺胆酸钠,佰境生物技术有限公司;谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、GSH、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、总胆固醇(total cholesterol,TC)及甘油三酯(triglyceride,TG)试剂盒,南京建成生物工程研究所;肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)及白细胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒,南京建成生物工程研究所;乙醇含量测定试剂盒,苏州科铭生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-1D型超净工作台,苏州净化设备有限公司;HC-3018R型高速离心机,美国Thermo公司;DHP-9080型电热恒温培养箱,上海博讯实业有限公司;MLS-3780型压力蒸汽灭菌锅,日本三洋公司;DP73型显微镜、BX43型超低温冰箱,日本Olympus公司;SHA-B型恒温水浴锅,金坛市精达仪器制造厂;ELX-800型酶标仪,美国Bio-Tek公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌株的活化及培养

将保存于-80 ℃甘油中的菌株,用无菌接种环在MRS固体培养基上划线接种,并在37 ℃倒置培养过夜。随后挑取单菌落接入MRS液体培养基,混匀后标记,并在37 ℃下培养18 h,即为菌株培养液,待用。

1.3.2 菌株降解乙醇能力的测定

参照高慧[18]的方法,采用重铬酸钾-硫酸法测定乙醇含量。以乙醇体积分数为x,吸光度为y,绘制乙醇标准曲线(y=0.194 5x-0.007 1,R2=0.994 7)。 以MRS液体培养基为溶剂,配制乙醇体积分数为5%、10%、15%的乙醇培养液,以不接种菌的培养液作为对照,将吸光度代入标准曲线中即可得到样品中的残留的乙醇含量,分析各菌株的乙醇降解能力。

1.3.3 菌株对ADH、ALDH活力影响的测定

参考问清江等[19]方法,离心菌株培养液,弃上清液后取菌体沉淀,用pH=8.0的磷酸缓冲液冲洗。混合菌体与缓冲液(体积比为1∶10),经冰浴超声(400 W,工作5 s间隔10 s)破碎后再次离心,取上清液作为酶液,按ADH、ALDH试剂盒说明测定酶活力。

1.3.4 菌株抗氧化能力的测定

1.3.4.1 DPPH自由基清除活性

参照Zhou等[20]方法,通过测定吸光度值(optical density,OD)。调节菌株培养液浓度,使其OD600为1。将1 mL样品与1 mL 0.2 mmol/L DPPH无水乙醇溶液混合,设置无水乙醇作为阴性对照,抗坏血酸作阳性对照,蒸馏水作空白对照,计算菌株DPPH自由基清除率。

1.3.4.2 ABTS+自由基清除活性

参照Zhang等[21]方法,向5 mL的ABTS+溶液(7.4 mmol/L)加入88 μL过硫酸钾溶液(2.6 mmol/L),室温静置12 h。再加入10 μL菌株培养液摇匀,避光静置6 min,测定OD734,计算菌株ABTS+自由基清除率。

1.3.4.3 超氧阴离子自由基清除活性

参照Tian等[22]方法,对植物乳植杆菌的超氧阴离子自由基清除率进行测定。用磷酸缓冲液(pH=7.4)配制72 μmol/L NBT液,30 μmol/L PMS液和338 μmol/L NADH液。按1∶1∶1∶1的体积比向菌悬液中加入NBT液、PMS 液和NADH 液,混合液室温孵育5 min,测定OD560,计算菌株超氧阴离子自由基清除率。

1.3.4.4 SOD与GSH-Px活性

菌株酶液制备方法同1.3.3节。SOD活力的测定采用黄嘌呤氧化酶法(羟胺法)。GSH-Px活力的测定采用2,4-二硝基硫氰基苯(2,4-dinitrothiocyanobenzene,DTNB)法。酶液中蛋白含量的测定采用二辛可酸(bicinchoninic acid,BCA)法。具体操作步骤遵照试剂盒说明书的指导执行。

1.3.5 菌株耐酸、耐胆盐能力的测定

参照贺珊珊等[23]方法微调,将菌株以2%的接种量接入不同pH值(2.0、2.5、3.0)的MRS液体培养基中,37 ℃培养3 h,测定OD600计算耐酸能力;将菌株以相同接种量接入到不同牛磺胆酸钠质量分数(0.10%、0.20%、0.30%、0.40%)的MRS液体培养基中,37 ℃培养4 h,测定OD600计算耐胆盐能力。菌株存活率(%)由实验OD600与对照OD600做比值得到。

1.3.6 动物实验设计

1.3.6.1 动物饲养条件

所有小鼠均在SPF级、室温(25±1)℃、12/12 h明暗循环的环境中饲养,实验前小鼠适应性饲养7 d后进行分组,用苦味酸对称重后的不同组小鼠做标记。

1.3.6.2 小鼠灌酒剂量的确定

参考文献[24]的方法。小鼠禁食不禁水12 h,随机分为5组 (每组有10只),各组小鼠分别按8、10、12、14、16 mL/kg体质量灌胃50%乙醇溶液。观察小鼠的醉酒状态,记录小鼠的醉酒数量、死亡情况,选择醉酒数最大而致死率最低的灌酒剂量进行后续实验。

1.3.6.3 菌悬液的制备

将1.3.5节筛选得到的具有较优抗氧化、耐酸、耐胆盐能力的植物乳植杆菌命名为FS5-5。将植物乳植杆菌FS5-5于MRS液体培养基中培养3代,用生理盐水洗涤离心并收集,通过菌落计数分别调整菌悬液浓度至1×107 CFU/mL(低剂量)、1×108 CFU/mL(中剂量)、1×109 CFU/mL(高剂量),用于小鼠灌胃。

1.3.6.4 植物乳植杆菌FS5-5对酒精代谢的影响的测量

小鼠禁食不禁水12 h,随机分为6组,每组10只,包括空白对照组(Ctrl)、酒精模型组(EtOH)、阳性对照组(Pos)、低剂量植物乳植杆菌FS5-5组(LFS)、中剂量植物乳植杆菌FS5-5组(MFS)、高剂量植物乳植杆菌FS5-5组(HFS),具体分组及灌胃方式见表1。监测小鼠的醉酒和醒酒状态,记录其醉酒时间(从给予酒精至翻正反射消失的时间)及醒酒时间(翻正反射重新出现至恢复正常的时间)。第2次灌胃后0.5、1.0、2.0、3.0 h,对小鼠眼眶取血,利用试剂盒测定血清乙醇浓度。

1.3.6.5 植物乳植杆菌FS5-5对ALI的辅助保护作用的测定

参考文献[7]的方法。将小鼠随机分为6组,每组10只,分组情况同1.3.6.4节。

共测试30 d。前15 d,按照小鼠体质量灌胃,Ctrl组和EtOH组灌胃生理盐水,其他组灌胃相应产品,灌胃剂量均为10 mL/kg,进行第1次灌胃。第1次灌胃1 h后进行第2次灌胃。除Ctrl组,其他组均用体积分数50%乙醇溶液以8 mL/kg质量浓度灌胃。后15 d,第1次灌胃与前15天相同,第2次灌胃时使用体积分数50%乙醇溶液以12 mL/kg质量浓度灌胃。

在实验期间记录小鼠的体质量变化,处死前测定小鼠的空腹体质量。

1.3.6.6 动物样品采集

灌胃结束,小鼠处死前过夜禁食16 h。过量异氯烷麻醉小鼠后处死,眼球采血,4 ℃下3 000 r/min离心10 min分离血清。解剖小鼠肝脏,预冷生理盐水清洗、擦干、称重,取左叶组织,质量分数为4%的多聚甲醛固定。收集剩余肝脏,使用液氮瞬间冷冻组织和器官,-80 ℃冰箱保存,以供后续实验进一步分析。肝脏指数通过将肝脏质量除以小鼠最后一天体质量并乘以100%得到。

1.3.6.7 生化指标测定

取-80 ℃保存的血清样品,利用试剂盒测定小鼠的肝功能指标(AST、ALT);取-80 ℃保存的肝脏组织,制备组织匀浆,利用试剂盒测定小鼠的氧化应激指标(MDA、SOD、GSH)、脂肪含量(TC、TG)及炎症因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)水平。

1.3.6.8 肝脏组织H&E染色

肝脏固定后,采用石蜡包埋、切片、脱蜡、烘干和染色,在200倍显微镜下观察肝脏组织病理变化并拍照,判定肝脏的病理损伤情况。

1.3.6.9 小鼠肝组织基因表达量的测定

利用Trizol试剂从小鼠肝组织中提取总RNA,通过逆转录试剂盒将所提RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板,采用荧光染料嵌合法进行实时荧光定量PCR,并借助StepOne实时PCR系统检测荧光信号。以小鼠β-actin作为内参基因,运用2-ΔΔCt法计算目标基因Cyp2e1、Nrf-2、NF-κB和Tlr4的mRNA表达水平。各组目标基因的表达水平均相对于Ctrl组(设为1.0)进行表示。引物由生工生物工程有限公司合成,具体引物序列见表2。

1.4 数据处理

每组数据均重复3次,使用Excel进行数据整理与统计,SPSS 26.0软件进行单因素方差分析(ANOVA)和(Duncan)多重比较分析,结果用平均值±标准偏差表示,并利用GraphPad Prism 9.5软件绘图。

2 结果与分析

2.1 菌株降解乙醇能力分析

各菌株在含体积分数为5%、10%、15%乙醇的培养基中的生长表现及乙醇降解率,见图1。由图1可知,各菌株降解乙醇的能力存在差异。实验选用的16株植物乳植杆菌在不同乙醇培养基中,对乙醇的降解率均随乙醇浓度的升高而降低,这一现象可能与高浓度乙醇对菌株的毒性作用有关。于莹莹[25]研究表明,高浓度乙醇可能通过破坏细胞膜完整性、抑制酶活性及干扰能量代谢,导致菌株代谢活力减弱。此外,不同菌株在相同乙醇浓度下的降解能力也存在显著差异。在体积分数为5%乙醇的培养基中,植物乳植杆菌FS5-5的乙醇降解效果最显著,降解率达到36.84%,其次是植物乳植杆菌DQ16-2菌株。当乙醇体积分数增至10%时,植物乳植杆菌FS5-5仍表现出最高的降解率,为23.40%,其次是FSDJ-5-3菌株。在体积分数15%乙醇下,植物乳植杆菌FS5-5的降解效率最高,为13.00%,其次是植物乳植杆菌FSDJ-5-3和植物乳植杆菌DQ16-2。由此表明,综合各菌株在不同乙醇体积分数下的降解效果,植物乳植杆菌FS5-5、植物乳植杆菌DQ16-2、植物乳植杆菌FSDJ-5-3在降乙醇效果方面表现出色。这些菌株可能通过使用醇作为碳源之一或通过乙醇脱氢酶或乙醛脱氢酶在醇降解中起作用[26]。

2.2 菌株对ADH、ALDH活力的影响

菌株对ADH、ALDH活力的影响结果见图2。由图2可知,ADH活力值较高的前3个植物乳植杆菌依次是FS5-5、FSDJ-5-3、AS1-2,酶活分别为35.99 U/mL、34.46 U/mL、34.42 U/mL,ALDH活力值较高的前3个植物乳植杆菌依次是植物乳植杆菌FS5-5、植物乳植杆菌37DD1-1、植物乳植杆菌DQ16-2,其酶活分别为 162.11、157.68、152.65 U/mL。综合比较植物乳植杆菌对ADH、ALDH活力的影响,植物乳植杆菌FS5-5较为突出,其次是植物乳植杆菌DQ16-2、植物乳植杆菌FSDJ-5-3。综合2.1节中降乙醇能力较强的菌株结果,降乙醇能力较佳的3株菌株,其对ADH、ALDH活力的影响也较强,推测植物乳植杆菌是通过影响ADH、ALDH来降解乙醇的[27]。

2.3 菌株抗氧化能力分析

基于2.1节和2.2节的结果,筛选出8株降乙醇方面表现优异的菌株。继续考察这些菌株的抗氧化能力,结果见图3。由图3(a)可知,8株植物乳植杆菌对DPPH自由基都有一定的清除效果,其中DLDJ-J-2-2、FS5-5、FSDJ-5-3的DPPH自由基清除率较高,分别为86.50%、82.04%、79.13%。如图3(b)所示,FS5-5的ABTS+自由基清除率达到83.81%,表现最优,与其余菌株除AS1-2外均有显著差异(P<0.05)。如图3(c)所示,FS5-5的超氧阴离子自由基清除效率最为显著,高达61.38%,DQ16-2和AS1-2次之。由图3(d)和图3(e)可知,植物乳植杆菌FS5-5和AS1-2均具有较高SOD活性,二者无显著性差异(P>0.05),同时,FS5-5的GSH-Px活性显著高于其他菌株(P<0.05)。结合自由基清除率实验结果,FS5-5在多种自由基清除实验中表现突出,AS1-2的ABTS+自由基和超氧阴离子自由基清除活性表现与FS5-5无显著性差异(P>0.05)。

乳酸菌在生长代谢过程中产生的酶,如SOD和GSH-Px,能够清除活性氧自由基从而减少氧化毒性,赋予乳酸菌对环境活性氧的耐受力及抗氧化能力[28]。各菌株间抗氧化能力的差异,可能是代谢产生的抗氧化物种类和含量不同所致[29]。SOD负责清除超氧化物,而GSH-Px有助于细胞抵御氧化应激、维持氧化还原平衡、解毒和调节肠道免疫[30]。以上结果可能说明,植物乳植杆菌胞内的SOD和GSH-Px在清除氧自由基中起到重要作用。综合来看,植物乳植杆菌FS5-5的抗氧化能力最强,具有缓解酒精诱导的氧化损伤潜力。

2.4 菌株耐酸、耐胆盐能力

胃酸的pH值通常在1.5～3.5,而肠道中存在着胆盐等物质。只有具备良好的耐酸、耐胆盐能力,益生菌才能在经过胃部时不被胃酸大量杀灭,顺利通过胃部进入肠道,并在肠道的胆盐环境中存活和定殖,从而发挥其有益作用。各植物乳植杆菌耐酸和耐胆盐能力结果见图4。由图4(a)可知,在pH升高时,所有菌株存活率上升。总体观察表明,植物乳植杆菌FS5-5、FSDJ-15-1和WW 3株植物乳杆菌具备较强的耐酸性,尤其在pH=3.0条件下,它们的生存率分别达到了49.00%、48.85%和46.38%,其中植物乳植杆菌FS5-5显示出最高的耐酸性能。这表明该菌株能够耐受胃液进入肠道,具备发挥益生作用的前提。

由图4(b)可知,随着胆盐浓度的增加,所有菌株的存活率均有所下降。在接近肠道胆盐质量分数为0.3%时,植物乳植杆菌FS5-5、植物乳植杆菌AS1-2、植物乳植杆菌WW存活率分别为56.11%、56.11%、55.25%,显著优于其他菌株(P<0.05)。结合质量分数为0.1%、0.2%、0.4%的数据,植物乳植杆菌FS5-5的耐胆盐能力最强。

2.5 灌酒剂量的确定

给小鼠灌胃50%乙醇溶液,依据小鼠的翻正反射消失判断醉酒状态,实验结果见表3。由表3可知,小鼠在8 mL/kg和10 mL/kg的灌胃剂量下,醉酒率分别为50%、80%,未出现死亡现象;在14 mL/kg和16 mL/kg的灌胃剂量下,小鼠全部醉酒,死亡率分别为10%、30%;在12 mL/kg的灌胃剂量下出现全部醉酒且无死亡现象,因此选择最佳灌酒剂量为12 mL/kg。

2.6 植物乳植杆菌FS5-5对小鼠醉酒情况的影响

2.6.1 植物乳植杆菌FS5-5对小鼠醉酒时间和醒酒时间的影响

通过灌胃体积分数为50%乙醇建立小鼠醉酒模型,验证植物乳植杆菌FS5-5对酒精性肝损伤的辅助保护作用。结果表明,除Ctrl组外,所有小鼠均出现不同程度的醉酒症状,不同实验组小鼠的醉酒情况结果见表4。由表4可知,EtOH组的醉酒时间最短,醒酒时间最长。与EtOH组相比,MFS组可显著延长醉酒时间(P<0.05),Pos组和HFS组极显著延长醉酒时间(P<0.01),其醉酒时间分别为EtOH组的1.50倍、1.69倍、1.81倍;与EtOH组相比,Pos组、MFS组和HFS组可极显著的缩短醒酒时间(P<0.01),其醒酒时间分别为模型组的0.68倍、0.66倍、0.55倍。植物乳植杆菌FS5-5具有增强小鼠酒精代谢的作用。

2.6.2 植物乳植杆菌FS5-5对小鼠血清乙醇浓度的影响

翻正反射丧失小鼠的中毒和恢复时间是醉酒最直接的表型指标。同时,血清乙醇浓度提供了小鼠对酒精暴露的反应的实质性证据。植物乳植杆菌FS5-5对小鼠血清乙醇浓度影响结果见表5。由表5可知,在血清乙醇浓度变化上,EtOH组灌胃前血清中几乎没有乙醇,灌胃后浓度迅速上升,1 h达34.86 mmol/L峰值,随后逐渐下降,3 h降至14.97 mmol/L。 Pos组各时间点的血清乙醇浓度均极显著低于EtOH组(P<0.01),表明其对小鼠乙醇代谢有促进作用。HFS组在改善小鼠乙醇代谢方面表现突出。与EtOH组相比,0.5 h时,HFS组血清乙醇浓度降低了39.65%(P<0.01),且降幅与Pos组无显著差异(P>0.05),表明在乙醇代谢初期就有强大促进作用;1 h时,HFS组血清乙醇浓度峰值降低了42.94%(P<0.01),效果优于Pos组,说明在乙醇浓度高峰时能更有效抑制其上升;3 h时,HFS组血清乙醇浓度降低了60.65%(P<0.01),且降幅与Pos组无显著差异(P>0.05),展现出持续高效的乙醇代谢能力。此外,具体来看,LFS组在0.5 h、1 h和3 h时,血清乙醇浓度分别降低了8.03%、6.80%和2.74%,而MFS组在相同时间点的降幅分别为26.87%、24.10%和29.66%。这些数据表明,LFS组和MFS组虽有促进乙醇代谢效果,但降低血清乙醇浓度的幅度和显著性均弱于HFS组。MFS组效果与Pos组相近,LFS组相对较弱。

植物乳植杆菌FS5-5具备一定降低小鼠血清乙醇浓度能力,且高剂量植物乳植杆菌FS5-5的功效强于海王金樽。推测HFS组可能通过直接降解乙醇等方式,有效降低小鼠血清乙醇浓度。各处理组灌胃初期血清乙醇浓度变化较缓,之后作用明显,或因激活相关代谢机制需一定时间。

2.7 植物乳植杆菌FS5-5对ALI小鼠体质量及肝脏指数的影响

植物乳植杆菌对ALI小鼠体质量及肝脏指数的影响结果见图5。体质量变化是小鼠最直观的健康指标,植物乳植杆菌FS5-5对ALI小鼠体质量的影响结果见图5(a)。由图5(a)可知,在实验过程中,乙醇诱导引起小鼠进食量减少,体质量上涨缓慢(P<0.01),15 d后,由于酒精摄取量加倍,除Ctrl组外,其他组小鼠体质量均不同程度下降,后缓慢恢复,说明酒精对小鼠造成了显著伤害,造模成功。在研究结束时,Pos组、MFS组和HFS组小鼠的体质量显著高于EtOH组(P<0.05)。植物乳植杆菌FS5-5的干预可显著减轻乙醇摄入对小鼠体质量的影响,且效果与海王金樽无显著性差异(P>0.05),其中HFS组效果最佳。

长期过量摄入酒精可诱发肝损伤,表现为肝脏肿大和肝脏系数的增加,植物乳植杆菌FS5-5对ALI小鼠肝脏指数的影响结果见图5(b)。由图5(b)可知,EtOH组小鼠的肝脏系数显著高于Ctrl组(P<0.05),表明小鼠在长期乙醇诱导下肝脏发生异常肿胀。海王金樽、中剂量和高剂量植物乳植杆菌FS5-5的干预显著降低了小鼠的肝脏系数(P<0.05),这三组小鼠的肝脏指数与Ctrl组无显著差异(P>0.05),其中HFS组效果最佳。以上结果表明,植物乳植杆菌FS5-5能显著减轻ALI小鼠体质量损失和肝脏异常肿大,其对酒精引起的肝脏损伤有改善作用。

2.8 植物乳植杆菌FS5-5对ALI小鼠肝脏组织病理形态学的影响

小鼠肝组织H&E染色200倍的形态学观测结果见图6。由图6可知,Ctrl组小鼠肝小叶结构清晰,细胞形态正常,无水肿、变性或坏死,汇管区未见炎症细胞浸润。相比之下,EtOH组肝细胞索排列紊乱,肝细胞广泛水肿变性至肝细胞边界不清晰,部分细胞内细胞核不可见,并伴有炎性细胞浸润,说明过量饮酒会导致小鼠肝脏组织损伤。相较于EtOH组,不同剂量植物乳植杆菌FS5-5和海王金樽干预后,小鼠肝细胞水肿现象明显减轻,炎性细胞数量明显减少。其中,Pos组和HFS组小鼠肝组织结构较为完整,肝脏病理变化不明显,健康状况接近正常小鼠,这表明高剂量植物乳植杆菌FS5-5对小鼠ALI有较强的改善作用。

2.9 植物乳植杆菌FS5-5对ALI小鼠生化指标的影响

2.9.1 植物乳植杆菌FS5-5对ALI小鼠血清肝功能指标的影响

ALT、AST是评估肝功能的关键指标[31],肝细胞受损时,这些酶会从细胞中泄漏,进入血液循环,使得转氨酶水平升高[32-33]。肝炎患者通常具有持续的高转氨酶水平,反映了正在进行的炎症和肝细胞肿胀、坏死和其他病变的存在。

植物乳植杆菌FS5-5对ALI小鼠血清肝功能指标影响结果见图7。由图7可知,灌胃酒精4周后,与Ctrl组相比,EtOH组ALT和AST水平显著升高(P<0.05),增加水平接近两倍,这证明酒精灌胃会严重损害肝细胞并影响其功能。相较于EtOH组,Pos组、MFS组和HFS组转氨酶水平均显著降低(P<0.05),其中MFS组和HFS组的AST活力与Ctrl组相比无显著差异(P>0.05)。此外,高剂量植物乳植杆菌FS5-5对肝功能的调节作用高于海王金樽,但差异不显著(P>0.05)。这表明植物乳植杆菌FS5-5能够降低小鼠血清ALT、AST水平,显示出一定护肝效果,有助于防止因酒精过量摄入引起的肝细胞坏死。

2.9.2 植物乳植杆菌FS5-5对ALI小鼠肝脏氧化应激指标的影响

酒精代谢的每一步都产生ROS,氧化应激是ROS产生和降解之间的失衡。在酒精代谢过程中,过量的乙醛被释放到血液中,并在黄嘌呤氧化酶的催化下转变为超氧化物,进而触发氧化应激。MDA作为自由基诱导的脂质过氧化产物,其生成是氧化应激的一个关键指标。SOD是ROS的主要清除剂,能将需氧生物体中超氧阴离子转化为氧气和过氧化氢,减轻氧化应激和炎症介质的活性,GSH同样可以抗氧化[34]。

植物乳植杆菌FS5-5对ALI小鼠肝脏氧化应激指标影响结果见图8。由图8可知,相较于Ctrl组,EtOH组的酒精摄入显著降低了肝脏SOD活性和GSH含量,显著增加了肝脏MDA含量(P<0.05),打破体内氧化与抗氧化的平衡,引发严重氧化应激损伤。高剂量植物乳植杆菌FS5-5和海王金樽的干预显著抑制了酒精摄入引起的肝脏SOD和GSH水平的下降和MDA水平的升高(P<0.05),且高剂量植物乳植杆菌FS5-5降低肝脏MDA水平的能力显著强于海王金樽(P<0.05),显著提高了肝脏的抗氧化水平。总体而言,高剂量植物乳植杆菌FS5-5可通过增强SOD活性及GSH水平,有效减轻氧化应激对肝脏的影响,从而显著降低肝组织中MDA含量,有效抑制了酒精代谢引起的肝脏氧化应激损伤。

2.9.3 植物乳植杆菌FS5-5对ALI小鼠肝脏脂肪含量指标的影响

尽管酒精所含热量不能直接转化为脂质,但其摄入过量会干扰体内脂质的正常代谢,促使肝脏TC、TG合成增加,引起ALI中的脂质代谢紊乱,造成肝脏脂质堆积[35]。

植物乳植杆菌FS5-5对ALI小鼠肝脏脂肪含量指标影响结果见图9。由图9可知,在乙醇干预4周后,与Ctrl组相比,TC和TG的积累分别增加了2.00倍和2.43倍(P<0.05)。与EtOH组比较,其余实验组除LFS组外,肝脏TC、TG含量均显著降低(P<0.05),其中HFS组小鼠肝脏TC、TG含量分别降低了51.00%、53.99%,与Ctrl组没有显著差别(P>0.05),且高剂量植物乳植杆菌FS5-5降低肝脏TG水平的能力优于海王金樽(P<0.05),显示出更优秀的调节肝脏TC和TG的能力。综上结果表明,高剂量植物乳植杆菌FS5-5可以降低乙醇诱导的脂质积累。

2.9.4 植物乳植杆菌FS5-5对ALI小鼠肝脏炎症因子指标的影响

炎症因子的大量释放是ALI的关键因素之一[36],炎症反应初期,IL-6的产生量与炎症的严重程度成正比。TNF-α通过促进细胞因子的生成来调节免疫反应[37],而IL-1β则增强了细胞因子的黏附性[38]。

通过ELISA法测定ALI小鼠肝脏细胞炎症因子表达情况,结果见图10。由图10可知,与Ctrl组相比,EtOH组小鼠肝组织中IL-6、TNF-α和IL-1β的水平显著升高(P<0.05),说明ALI会引发小鼠肝脏炎症反应。经植物乳植杆菌FS5-5和海王金樽干预后,与EtOH组相比,小鼠肝组织中上述炎症因子水平均显著降低(P<0.05),其中,高剂量植物乳植杆菌FS5-5干预后,3种小鼠肝脏炎症因子含量均回归正常水平,与Ctrl组无显著差异(P<0.05)。这些结果表明,高剂量植物乳植杆菌FS5-5干预可以显著降低肝组织TNF-α、IL-6和IL-1β含量,增强促炎性细胞因子的调节能力,从而缓解肝损伤和炎症。

2.10 植物乳植杆菌FS5-5对ALI小鼠肝脏mRNA表达水平的影响

肝脏是酒精代谢的主要器官,长期大量饮酒时,线粒体乙醇氧化体系发挥主导作用,其中Cyp2e1至关重要。它代谢酒精产生自由基,过度表达会引发氧化应激损伤[5]。Nrf2信号靶点在对抗氧化应激损伤中地位关键,正常时与Keap1结合于细胞质呈无活性状态,机体受损伤引发氧化应激时,Nrf2与Keap1分离,激活入核调控下游基因表达以对抗氧化损伤[39]。植物乳植杆菌FS5-5对ALI小鼠肝脏Nrf2、Cyp2e1、NF-κB、Tlr4的mRNA表达水平影响结果见图11。由图11(a)和(b)可知,与Ctrl组相比,EtOH组Cyp2e1基因表达显著升高(P<0.05),加速酒精代谢的同时也生成了大量的自由基,加重了肝脏氧化应激损伤,同时Nrf2基因表达显著降低(P<0.05),这可能是因为酒精及其代谢产物干扰了Nrf2的合成与激活过程,持续高强度的氧化应激使Nrf2的消耗超过其生成速度。经海王金樽和不同剂量植物乳植杆菌FS5-5干预后,Cyp2e1基因表达显著下调(P<0.05),自由基生成减少,同时Nrf2基因表达显著上调(P<0.05),减轻肝脏氧化应激损伤,其中HFS组效果最佳,对2种基因的调节作用均显著优于Pos组(P<0.05)。

大量饮酒会破坏肠道菌群和肠黏膜,使LPS转移至肝脏,激活肝内Tlr4受体,进而激活NF-κB蛋白引发炎症损伤。正常生理状态下,NF-κB与IκB相互作用无调节活性,机体受损伤时,NF-κB与IκB分离入核,调节下游炎症因子表达[39]。由图11(c)和(d)可知,与Ctrl组相比,EtOH组NF-κB与Tlr4基因表达均显著升高(P<0.05),表明LPS进入肝脏激活受体Tlr4基因表达,进而增强NF-κB基因表达,引起肝脏炎症损伤。经海王金樽和不同剂量植物乳植杆菌FS5-5干预后,NF-κB与Tlr4基因表达均显著下调(P<0.05),减轻肝脏炎症损伤,其中HFS组效果最佳,对2种基因的调节作用均显著优于Pos组(P<0.05),且Tlr4基因表达已与Ctrl组无显著性差异(P>0.05)。

总之,植物乳植杆菌FS5-5凭借其强大的降解乙醇以及调节肝脏中Nrf2、Cyp2e1、NF-κB、Tlr4基因表达的能力,实现了对肝脏氧化应激损伤和炎症损伤的双重保护。

3 结 论

本研究发现植物乳植杆菌FS5-5具有高效的乙醇降解能力,能够直接降低酒精摄入并调节关键基因表达,进而增强肝脏抗氧化能力,减轻ALI症状。该菌株的ADH和ALDH活力分别为35.99 U/mL和162.11 U/mL。同时,植物乳植杆菌FS5-5具有良好的耐酸、耐胆盐及抗氧化能力。动物实验结果显示,中、高剂量植物乳植杆菌FS5-5灌胃均可显著延长醉酒时间、减少醒酒时间,并降低血清乙醇浓度。HFS组(1×109 CFU/mL)酒精灌胃3 h后,血清乙醇浓度与EtOH组相比降低了60.65% (P<0.01),展现出持续高效的乙醇代谢能力。此外,HFS组可显著减轻酒精性肝损伤小鼠的肝组织病理损伤程度、降低肝脏MDA浓度、降低TG浓度、提高GSH含量。同时,可降低血清转氨酶、炎症因子水平,提高抗氧化酶活性,有效缓解肝脏的氧化应激(SOD水平)和炎症损伤(IL-6、IL-1β、TNF-α水平),降低肝脏中总胆固醇含量。此外,该菌株能够通过调节肝脏中Nrf2、Cyp2e1、NF-κB、Tlr4基因表达,降低促炎细胞因子,减轻肝脏氧化应激和脂质蓄积,从而对酒精性肝损伤产生辅助保护作用。总之,植物乳植杆菌FS5-5有望开发成为对酒精性肝损伤有辅助保护作用的保健食品。

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Effect of a Lactiplantibacillus plantarum Strain on Alcoholic Liver Injury

XIA Suning1, WU Rina1, LI Tong1, YANG Haixin1, AN Feiyu1, XUE Ruixia1, WU Junrui1,*, ZE Xiaolei2,*

(1.Food Science College/Liaoning Engineering Research Center of Food Fermentation Technology/Shenyang Key Laboratory of Microbial Fermentation Technology Innovation,Shenyang Agricultural University,Shenyang 110866, China; 2.Microecology Research and Development Center of BYHEALTH Nutritional Health Research Institute, Guangzhou 510663, China)

Abstract： Lactiplantibacillus plantarum is a probiotic with multiple health benefits. To investigate its effects against alcoholic liver injury, 16 strains of Lactiplantibacillus plantarum were isolated from traditional fermented foods. Their ethanol degradation capacity and effects on alcohol dehydrogenase and acetaldehyde dehydrogenase activities were evaluated, and 8 strains that demonstrated high alcohol metabolism rates and reduced hepatic oxidative stress levels were preliminarily screened. Subsequent assessment of antioxidant capacity, acid resistance, and bile salt tolerance of these 8 strains was carried out, and an optimal strain, Lactiplantibacillus plantarum FS5-5 was identified. An alcoholic liver injury mouse model was established to investigate the effects of Lactiplantibacillus plantarum FS5-5. Results showed that FS5-5 exhibited a strong alcohol metabolism capability with alcohol dehydrogenase and acetaldehyde dehydrogenase activities reaching 35.99 U/mL and 162.11 U/mL, respectively. Meanwhile, high-dose FS5-5 significantly prolonged drunkenness duration, shortened sobering time, and reduced serum ethanol concentration (P<0.05). Furthermore, the high-dose FS5-5 group (1×109 CFU/mL) notably alleviated pathological liver damage, decreased hepatic malondialdehyde and triglyceride levels, increased glutathione content, reduced serum transaminases and inflammatory factor levels, enhanced antioxidant enzyme activity, effectively mitigated hepatic oxidative stress (superoxide dismutase level) and inflammatory injury (IL-6, IL-1β, TNF-α levels), and lowered total cholesterol content. Mechanistic studies demonstrated that this strain exerted hepatoprotective effects against alcoholic liver injury by regulating hepatic gene Nrf2, Cyp2e1, NF-κB, and Tlr4 expression, reducing pro-inflammatory cytokine levels, and alleviating oxidative stress and lipid accumulation. This research provided theoretical basis for developing functional foods with auxiliary protective effects against alcoholic liver injury.

Keywords： probiotic; alcoholic liver injury; oxidative stress; inflammatory factors; glutathiones

doi：10.12301/spxb202400425

文章编号：2095-6002(2025)04-0050-11

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中图分类号： TS201.3

文献标志码： A

收稿日期： 2025-01-21

基金项目： 国家自然科学基金面上项目(32172279); 辽宁省科学技术计划项目(2024JH2/101900005); 沈阳农业大学引进人才(高层次)科研启动项目(2023YJRC002); 沈阳市科技创新平台项目(21-103-0-14、21-104-0-28)。

Foundation: National Natural Science Foundation of China (32172279);Liaoning Provincial Science and Technology Program Project (2024JH2/101900005);Shenyang Agricultural University High-Level Talent Introduction Scientific Research Startup Fund Project (2023YJRC002);Shenyang Science and Technology Innovation Platform Project (21-103-0-14,21-104-0-28)．

第一作者： 夏苏宁,女,硕士研究生,研究方向为食品微生物。

*通信作者： 武俊瑞,男,教授,博士,主要从事食品微生物方面的研究;迮晓雷,男,高级工程师,博士,主要从事益生菌方面的研究。

(责任编辑：李 宁)